Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Pomiar sygnałów reporterowych lucyferazy, które odpowiadają γ-sekretazie rozszczepienia APP-C99 ( białka prekursorowego amyloidu - C-końcowy fragment 99-aminokwasu)
UWAGA: Proszę zapoznać się z poprzednimi publikacjami, aby uzyskać szczegółowe opisy generacji ogniw CG (C99-Gal4).
- Nasiona komórek CG (20 000 komórek/studzienkę) na 96-dołkowych mikropłytkach o końcowej objętości 200 μl/dołek w pożywce wzrostowej, która składa się ze zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) plus 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 μg/ml blasticydyny, 250 μg/ml antybiotyku (e.g., zeocyna), i 200 μg/ml higromycyny B.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Przenieść mikropłytki do nawilżonego inkubatora CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
- Usuń 100 μl podłoża wzrostowego z każdej studzienki.
- Dodać 100 μl/basenik pożywki wzrostowej zawierającej 2 μg/ml tetracykliny z 0,2% dimetylosulfotlenkiem (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorofenacetylo-L-alanylo)]-S-fenyloglicyny t-butylestru (DAPT) lub innymi pokrewnymi inhibitorami ErbB1/ErbB2.
- Inkubować potraktowane komórki CG w mikropłytkach w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
- Usunąć 150 μl/studzienkę z mikropłytek.
- Dodać 50 μl/studzienkę odczynnika do oznaczania lucyferazy (patrz Tabela materiałów).
- Przenieś mikropłytki do czytnika mikropłytek luminescencyjnych.
- Utrzymuj mikropłytki w temperaturze pokojowej przez 5 minut, delikatnie mieszając.
- Określ luminescencję emitowaną przez lucyferazy Firefly za pomocą predefiniowanego programu przechowywanego w czytniku mikropłytek luminescencyjnych.
