Immunohistochemia do identyfikacji regionu miejsca sinawyego w wycinkach mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Schmidt, K. et al., Lokalizacja miejsca sinawego w mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2019)

Protokół ten przedstawia zastosowanie immunohistochemii do identyfikacji regionów miejsca sinawyego w sekcjach mózgu myszy. Poprzez celowanie w β-hydroksylazę dopaminy za pomocą zielonych przeciwciał znakowanych fluoroforem, neurony wytwarzające noradrenalinę są wizualizowane pod mikroskopem jako zielona fluorescencja.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Krojenie mózgu

1. Aby unieruchomić i znieczulić myszy poprzez zastosowanie 3% izofluranu.
   1. Namocz wacik z kroplami izofluranu i umieść go w probówce do mikrowirówek o pojemności 15 ml. Umieść nos zwierzęcia w rurki i pozwól mu wdychać izofluran. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca.
2. Połóż zwierzę na grzbiecie i unieruchamij je, przygniatając jego kończyny szpilką T, mając dostęp do brzucha.
3. Potnij zwierzę nożyczkami chirurgicznymi, przecinając skórę brzucha i przecinając skórę w okolicy klatki piersiowej. Przypnij skórę za pomocą szpilek T. Następnie przerwij błonę otrzewnową aż do klatki piersiowej. Odsłoń serce, rozbijając klatkę piersiową i przecinając przeponę.
4. Przetnij prawy przedsionek, aby krew mogła wypłynąć ze zwierzęcia. Włożyć strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 25 do lewej komory i przelać 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   UWAGA: To pozwala roztworowi przepływać przez krążenie ogólnoustrojowe i wychodzić przez prawe przedsionki.
5. Wyjąć strzykawkę o pojemności 10 ml i wprowadzić igłę o rozmiarze 25 dołączoną do strzykawki o pojemności 60 ml. Przelej przez lewą komorę 50 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA).
   1. Przygotuj lodowaty 4% roztwór PFA, rozcieńczając 10% roztwór PFA w H₂O i schładzając końcowy 4% roztwór PFA w temperaturze 4 °C.
6. Odizoluj głowę myszy i usuń mózg z czaszki.
   1. Odetnij skórę od szyi, a następnie przetnij w kierunku oczu, aby odsłonić czaszkę. Rozbij czaszkę od szyi do nosa, a następnie od jednej gałki ocznej do drugiej. Obierz czaszkę i wytnij cały mózg.
7. Inkubuj mózg w 4% PFA przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
8. Przenieś mózg za pomocą kleszczy do stożkowej rurki o pojemności 50 ml wypełnionej 25 ml 30% roztworu sacharozy. Utrzymuj go w temperaturze 4 °C przez 48-72 godziny, aż mózg opadnie na dno rurki.
9. Przetnij mózg za pomocą dorosłej myszy wycinka mózgu matrycy koronalnej przez śródmózgowie (~ 3 mm za bregmą). Zachowaj sekcję mózgu zawierającą pień mózgu.
   UWAGA: Spowoduje to powstanie dwóch sekcji mózgu – jednej zawierającej większość kory mózgowej (przedniej części cięcia) i drugiej zawierającej pień mózgu/móżdżek (tył cięcia). Użyj sekcji pnia mózgu, aby wykonać następujące kroki.
10. Osadź sekcję pnia mózgu z powierzchnią cięcia umieszczoną na dnie formy do zatapiania, otoczoną związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT); Osadzony mózg przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C i zamrażać przez co najmniej 12 godzin – do dalszego użycia.
11. Cięcie kriostatu: umieścić formę do osadzania zawierającą mózg w OCT w kriostacie; Inkubuj go w kriostacie przez kilka godzin, aby dostosować temperaturę bloku mózgowego do temperatury kriostatu.
12. Oderwij formę do osadzania, aby odsłonić blok OCT zawierający mózg.
13. Użyj żyletek, aby usunąć nadmiar OCT z powierzchni bloku bez dotykania mózgu.
14. Zamontuj blok OCT na uchwycie kriostatu, odsłaniając przeciętą powierzchnię mózgu do przodu.
15. Dostosuj powierzchnię cięcia mózgu tak, aby była zorientowana równolegle do żyletek kriostatu.
16. Przytnij mózg, zaczynając od rdzenia, przecinając odcinki 100 μm rostralnie.
17. Przycinaj rostralnie, aż móżdżek i pień mózgu zostaną pocięte jako jeden ciągły plasterek. Rozpocznij zbieranie plastrów o grubości 50 μm.
    UWAGA: Gdy przycina się rostralnie od rdzenia, pień mózgu i móżdżek zostaną przecięte jako dwie oddzielne sekcje. W odcinkach rostralnych pień mózgu i móżdżek ostatecznie połączą się na poziomie 4. komory. Gdy boczne krawędzie 4. komory są dobrze uformowane, móżdżek i pień mózgu wyjdą jako jeden ciągły plasterek.
    1. Zbierz wycinek mózgu otoczony OCT za pomocą kleszczy i umieść go w studzience na 24-dołkowej płytce wypełnionej PBS (Rysunek 1a). Locus coeruleus (LC) będzie najbardziej widoczny, gdy móżdżek i wzgórek dolny spotkają się ze sobą w odległości ~-5,52 mm za bregmą (Rysunek 2b).
       UWAGA: Najbardziej przednia część LC zniknie, gdy móżdżek zostanie w pełni przecięty i nie będzie już otaczał dolnego wzgórka w odległości ~-5,34 mm za bregmą (Rysunek 2c).

2. Immunohistochemia dopaminy β-hydroksylazy (DBH) lub hydroksylazy tyrozyny (TH) (Figura 1)

1. Dzień 1
   1. Umyj wybrane plastry trzy razy przez 5 minut w PBS.
   2. Przepuszczać przez 24 godziny w 0,5% roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z detergentem (PBSD) w temperaturze 4 °C.
      1. Rozcieńczyć 125 μl detergentu w 25 ml PBS.
2. Dzień 2
   1. Umyj plastry trzy razy przez 5 minut w 0,5% PBSD.
   2. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe, anty-DBH lub anty-TH, przez 18 godzin w rozcieńczeniu 1:500 w 0,5% PBSD w temperaturze 4 °C.
3. Dzień 3
   1. Umyj plastry trzy razy przez 10 minut w 0,5% PBSD.
   2. Dodaj pożądane przeciwciało drugorzędowe (488 anty-królik osła dla zielonej fluorescencji) w rozcieńczeniu 1:1000 w 0,5% PBSD przez 16 godzin.
   3. Owiń 24-dołkową płytkę aluminiową i umieść w temperaturze 4 °C.
   4. Umyj plastry trzy razy przez 5 minut w 0,5% PBSD.
   5. Prać przez 5 minut w PBS.
   6. Przełóż plastry pędzlem ołówkowym do pojemnika na wodę.
   7. Zamontuj plastry unoszące się w wodzie na naładowanych zjeżdżalniach.
   8. Sekcje szkiełek nakrywkowych z twardym podłożem montażowym Beta-hydroksylaza dopaminy
   9. Suszyć zamontowane sekcje mózgu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   10. Obrazuj wycinki mózgu pod mikroskopem konfokalnym lub fluorescencyjnym z ustawieniami wykrywania sygnałów z odpowiedniej drugorzędowej długości fali fluoroforu przeciwciała.
   11. Dostosuj mikroskop do płaszczyzny ogniskowej wycinka mózgu i zrób pojedynczy obraz w 10-krotnym powiększeniu.

Wyniki

Rycina 1: Wykrywanie LC poprzez barwienie immunologiczne wycinków mózgu pod kątem DBH lub TH. (a) Jeden mózg myszy został pocięty na plastry o grubości 50 μm wokół pnia mózgu i zebrany w dwóch 24-dołkowych szalkach. Każdy 5-8 pobrany wycinek mózgu był umieszczany na pokrytym folią szkiełku nakrywkowym w celu obrazowania za pomocą XFM. Te plasterki są oznaczone niebieskimi numerami między dołkami. Są...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Macierz fragmentatora mózgu dorosłej myszy	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Przeciwciało wtórne przeciwko królikowi, Alexa Fluor 488 (źródło - osioł)	Thermo Fisher Naukowy	A-21206
Szkiełka szklane ładowane	Genesee	29-107
Mikroskop konfokalny	Zeiss	LSM 800
Kriostat	Microm GmbH	HM 505E
Ostrza do cięcia kriostatu	Thermo Fisher Naukowy	MX35
Nożyczki Mini, 9,5cm	Antech Diagnostcs	503241
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol)	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
Przeciwciało przeciwko β-hydroksylazie dopaminy (DBH) - produkcja własna (źródło - królik)	B. Eipper	-
Przeciwciało dopaminy β-hydroksylazy (DBH) - dostępne w handlu (źródło - królik)	Sygnalizacja komórkowa	8586
Probówki Falcon, 50ml	Stany Zjednoczone Naukowe	339652
Foran (izofluoran)	Baxter	NDC 1019-360-60
Kleszcze Micro Adson	Antech Diagnostcs	501245
Twarde nośniki montażowe	Nauki elektromagnetyczne	17984-24
Mikroskop	Pascal	LSM 5
Płytki wielodołkowe, 24 dołki	Thermo Fisher Naukowy	930186
Optymalna temperatura skrawania mieszanki (OCT)	VWR/ technologia tissue	102094-106
Paraformaldehyd (PFA)/ formalina 10%	Fisher Naukowy	Zobacz materiał SF98-4
Jednorazowe formy do zatapiania Peel-A-Way	Polysciences Inc.	18646A
Pędzel ołówkowy
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Technologia życia	14190250
Żyletki	Amazonka	ASIN: B000CMFJZ2
Szpatułki	Antech Diagnostcs	14374
Szpilki T	Magazyn biurowy	344615
Mózg myszy we współrzędnych stereotaktycznych, Paxinos i Franklin, wydanie 3	Amazonka	ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (do przygotowania PBSD)	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-500ml
Przeciwciało przeciwko hydroksylazie tyrozyny (TH) (źródło - królik)	EMD Millipore	AB152
Mikroskop fluorescencyjny szerokokątny	Zeiss	Axio Zoom.V16