Znakowanie wirusowe i przeszczepianie komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju przyśrodkowego do badań in vivo

Streszczenie

Źródło: Vogt, D. i inni., Znakowanie za pośrednictwem wirusa i przeszczepianie komórek wyniosłości zwoju przyśrodkowego (MGE) do badań In Vivo. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film demonstruje znakowanie wirusowe i przeszczepianie komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju (MGE) do badań in vivo. Przedstawiono w nim etapy związane z transdukcją komórek MGE za pomocą reportera wirusa, przeszczepianiem tych transdukowanych komórek do kory młodego myszy i umożliwianiem ekspresji reporterowej w określonych podtypach interneuronów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przygotowanie do lentiwirusa (krok opcjonalny)

1. Podziel trzy 10-centymetrowe płytki z HEK293T komórkami dla każdego lentiwirusa, który ma być wykonany w obecności 10 ml DMEM/10% FBS i zwiększ do ~60-70% konfluencji. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 .}
2. Transfekować następujące plazmidy DNA (łącznie 10 μg) do każdej płytki za pomocą dowolnego odczynnika do transfekcji: 6,4 μg wektora lentiwirusowego CAG-Flex-GFP, 1,2 μg pMD2.G (koduje VSV-g), 1,2 μg pRSV-Rev i 1,2 μg pMDLg/pRRE. Trzy wektory opakowań lentiwirusowych są dostępne w handlu.
   nuta: To podejście wykorzystuje wektory lentiwirusowe 3. generacji, ale wektory 2. generacji i związane z nimi plazmidy również będą działać.
3. Przygotuj pojemnik na odpady zawierający 10% roztwór wybielacza w okapie z certyfikatem BSL2, aby dezaktywować wszelkie roztwory lub urządzenia, które miały kontakt z lentiwirusem lub je zawierały. Następnie całkowicie usuń pożywkę 4-6 godzin po transfekcji do roztworu wybielacza, zastąp taką samą objętością nowego podłoża i pozwól komórkom rosnąć.
4. Po 4 dniach zebrać pożywkę do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 15 minut, aby osadzać wszelkie resztki komórek. Następnie przefiltrować supernatant przez membranę 0,45 μm. Każdy filtr o niskim poziomie wiązania białek, taki jak PVDF, działa dobrze. ostrożność: Umieść zarówno stałe, jak i płynne odpady wirusowe w roztworze wybielacza.
5. Załadować 30 ml przefiltrowanego supernatantu do probówek ultrawirówek i do ultrawirówki. Wirować przy 100 000 x g przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C. Otwórz probówki wirówkowe w okapie BSL2 i usuń supernatant do 10% wybielacza. Dodaj ~100 μl PBS do osadu, co daje miana 1x10⁷ do 1x10⁸ jednostek zakaźnych/ml. Porcję podwielokrotności należy podać następnego dnia i przechowywać w temperaturze -80 °C. Podwielokrotności lentiwirusa są stabilne w temperaturze -80 °C przez co najmniej sześć miesięcy.
6. Ważna uwaga: Wiele instytucji ma teraz rdzenie wirusowe. Pozyskać skoncentrowany wirus o minimalnym mianie 1x10⁷ jednostek zakaźnych/ml, aby uzyskać optymalne wyniki.

2. Myszy dawcy do sekcji MGE

1. Najpierw ustaw krycie w czasie między linią zainteresowania wyrażającą Cre a myszą typu dzikiego (WT) lub myszą, która wyrazi reportera po rekombinacji za pośrednictwem Cre.
   nuta: Wiele linii Cre-driver jest transgenicznych i jest utrzymywanych i hodowanych w stanie hemizygotycznym. W związku z tym tylko połowa zarodków będzie zawierała transgen Cre. DNA można szybko przygotować z zarodków do krótkiej reakcji PCR w celu wykrycia allelu Cre. Zarodki Cre⁺ mogą być następnie pobrane tak, aby wykorzystana została tylko tkanka MGE o pożądanym genotypie. Alternatywnie, do selekcji zarodków do sekcji i przeszczepienia MGE można użyć osoby zgłaszającej zależnej od Cre.
2. Oblicz, który dzień będzie odpowiadał E13.5. Jeśli zwierzęta zostały sparowane poprzedniego wieczoru, dzień wtyczki wynosi 0,5. Zamów myszy w ciąży w ciąży w czasie lub samicę WT ze szczeniętami P1, aby mieć myszy po urodzeniu (P)1 w dniu, w którym tkanka dawcy będzie E13.5. Alternatywnie, należy zorganizować te krycia w domu na tydzień przed sparowaniem zwierząt-dawców.
   nuta: Poprzednia strategia polegająca na generowaniu zarówno zarodków/szczeniąt E13,5, jak i P1 na ten sam dzień jest często trudna do niezawodnego wykonania.

3. Przygotowanie mediów, narzędzi i sprzętu.

1. Przygotować odczynniki i narzędzia do przygotowania komórek MGE (Tabela 1).
   1. Przygotuj czystą powierzchnię i umieść na niej czyste kleszcze, nożyczki i nóż mikrochirurgiczny lub cienkie kleszcze (do precyzyjnego wycięcia tkanek).
   2. Przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) do sekcji i zmodyfikowaną pożywkę orła (DMEM) firmy Dulbeco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do transdukcji.
   3. Wstępnie inkubować 20-30 ml DMEM/10% FBS w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez około 1 godzinę. Pokrywę należy poluzować, aby umożliwić wymianę gazową i wyrównanie pH pożywki.
      nuta: Preinkubację pożywki można przygotować tuż przed rozpoczęciem sekcji.

4. Przygotowanie komórek MGE

1. Złożyć ciężarną mysz w ofierze zgodnie z zatwierdzonym protokołem zwierzęcym i usunąć zarodki na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą lodowaty HBSS.
2. Usuń mózg z każdego zarodka za pomocą lunety preparacyjnej (wykonuj pojedynczo, pozostawiając resztę zarodków w lodowatym HBSS), a następnie przystąp do wycinania tkanki MGE.
   nuta: Poniżej i na rysunku 1 szczegółowo opisano kluczowe kroki pokazujące, jak usunąć MGE.
   1. Ustaw mózg brzuszną stroną skierowaną do góry (ryc. 1A, A'). Uwaga: nie ma nic złego w tym, aby strona grzbietowa była skierowana do góry. Przetnij mózg na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, aby uzyskać dwa kawałki. Pokazano przykład mózgu poddanego hemisekcji (ryc. 1B, B'); Zauważ, że grzbietowe (leżąca nad nią kora) i brzuszne aspekty mózgu pokrywają i otaczają tkankę wyniosłości zwojowej (GE).
   2. Następnie, ręką dominującą, przytrzymaj albo bardzo cienkie kleszcze, albo nóż kłujący (Tabela 1), jednocześnie unieruchamiając półkulę kleszczami trzymanymi przez rękę niedominującą. (Przyśrodkowy aspekt półkuli powinien być skierowany do góry). Rozłóż tkankę grzbietową i brzuszną za pomocą kleszczy i noża kłującego, aby odsłonić leżącą pod spodem tkankę GE (ryc. 1C i zilustrowana na rycinie 1C').
      nuta: Usunięcie części pożywki z płytki Petriego może ułatwić stabilizację tkanki podczas wykonywania sekcji MGE.
   3. Wykonuj proste cięcia nożem lub cienkimi kleszczami, aby oddzielić tkanki CGE, LGE i przegrody (patrz przykładowe cięcia oznaczone czerwonymi przerywanymi liniami, rysunki 1D i D'). Cięcia te mogą być wykonywane w dowolnej kolejności.
      nuta: Wyobraźmy sobie MGE jako "pudełko", które jest wycinane z otaczającej tkanki. Pomaga to w powtarzalnym wykonywaniu podobnych cięć dla każdej sekcji, zmniejszając w ten sposób zmienność sekcji tkanek.
   4. Na koniec obróć MGE na bok i odetnij spód (co było bocznym aspektem mózgu). Powoduje to usunięcie strefy płaszcza MGE (odrzucić na rysunkach 1E i 1E') od reszty MGE. Pozostały aspekt MGE zawiera przede wszystkim część MGE ze strefą komorową i podkomorową, które zawierają prawie wszystkie komórki progenitorowe MGE. Kontynuuj z tą tkanką.
3. Ważna uwaga: Dodanie żelu silikonowego na dno szalki Petriego może służyć jako doskonała powierzchnia do rozwarstwiania, ponieważ chroni delikatne końcówki kleszczy i zapewnia miękką powierzchnię do przypinania tkanki kleszczami.

5. Znakowanie i przeszczepianie lentiwirusów

1. Przenieś probówki z tkanką MGE do kaptura z certyfikatem BSL2 i wyjmij nośnik.
   nuta: Tkanka MGE jest wystarczająco duża, aby była widoczna i osiądzie na dnie probówki, umożliwiając łatwe i delikatne usunięcie zimnego podłoża.
2. Dodać ~500 μl pożywki DMEM/10% FBS, która była wstępnie inkubowana w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C. Następnie dodać polibren, aby ułatwić transdukcję do każdej probówki w końcowym stężeniu 8 μg/ml. Rozetnij tkankę MGE, aby utworzyć zawiesinę pojedynczej komórki za pomocą końcówki pipety P1000. Na koniec dodaj ~15-20 μl skoncentrowanego lentiwirusa do każdej probówki.
3. Ważna uwaga: Tryturacja 10-12 razy jest wystarczająca do rozbicia tkanki MGE z pojedynczego zarodka, ale może być wymagane więcej trituracji, jeśli wiele MGE jest połączonych razem. Wypróbuj różne warunki trituracji, aby określić, co działa najlepiej.
4. Dokładnie zamknij każdą probówkę, odwróć do mieszania, a następnie umieść wszystkie probówki w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Inkubuj komórki w lentiwirusie przez co najmniej 30 minut i do 1 godziny, dłuższe czasy spowodowały zmniejszenie żywotności komórek. Odwracaj rurki co 10 minut, aż skończy się czas.
5. Po inkubacji z lentiwirusem wyjmij probówki z inkubatora i odwiruj przy ~700 x g przez 3 minuty w celu osadzenia komórek. W okapie BSL2 usuń supernatant i wyrzuć do 10% wybielacza. Następnie dodaj 1 ml DMEM/10% FBS i rozetrzyj osad 2-3 razy w celu umycia, a następnie ponownie odwiruj z tą samą prędkością, aby osadzać komórki. Powtórz ten krok prania jeszcze 2-3 razy, aby usunąć nadmiar wirusa.
   nuta: Przeprowadzić etapy wirowania w temperaturze 4 °C; jednak nie zaobserwowano zmniejszonej żywotności, gdy krótkie spiny są wykonywane przy RT.
6. Po ostatnim umyciu usuń jak najwięcej pożywki i połóż każdą tubkę na lodzie. Ze względu na resztki pożywki po bokach probówki, ~2-3 μl pożywki pokryją osad komórkowy do czasu rozpoczęcia procedury przeszczepu.

6. Transplantacja i walidacja

1. Zdobądź szczenięta żywiciela P1 i przygotuj obszar zabiegu, spryskując go 70% etanolem. W celu zachowania sterylności podczas zabiegu zaleca się wykonywanie tych zabiegów w dedykowanym czystym pomieszczeniu zabiegowym. Ponadto używaj autoklawowanych narzędzi chirurgicznych i sterylizuj powierzchnie, z którymi szczenięta będą miały kontakt, używając 70% etanolu. Przykład reprezentatywnego sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia przeszczepów oraz reprezentatywny obszar zabiegowy przedstawiono na rysunku 2.
   Uwaga: Chociaż ta procedura jest wstrzyknięciem małych objętości, a nie zabiegiem chirurgicznym, który wymagałby nacięcia, otwartej rany lub szwów, nadal zaleca się użycie nowej mikropipety dla każdej myszy, która ma zostać wstrzyknięta. Mikropipety są sterylizowane termicznie po pociągnięciu i ukosowaniu na powierzchni, która została spryskana 70% etanolem i jest przechowywana w szczelnie zamkniętym pojemniku.
   1. Mikropipety należy wytwarzać tak, aby miały średnicę końcówki między 40-80 μm. Przestrzeganie tych wymiarów przyniesie optymalne wyniki. Wysterylizuj termicznie mikropipety po pociągnięciu i ukosowaniu na powierzchni, a następnie spryskaj 70% etanolem przed przechowywaniem mikropipet w szczelnie zamkniętym pojemniku.
      Uwaga: Alternatywnie, jeśli dostęp do urządzeń potrzebnych do wytworzenia tych igieł (Tabela 1) jest ograniczony, należy użyć innego urządzenia do wstrzykiwań. Jednak mogą one nie być tak dobrze dopasowane jak mikropipety ze względu na różne średnice.
   2. Pobrać olej mineralny do strzykawki o pojemności 1 ml i za pomocą igły 30 1/2 G całkowicie napełnić szklaną pipetę olejem mineralnym. Następnie zamontuj tłok na urządzeniu stereotaktycznym, a następnie przymocuj szklaną pipetę do urządzenia stereotaktycznego i załaduj ją na tłok. Za pomocą napędu hydraulicznego przesunąć tłok mniej więcej do połowy szklanej pipety, usuwając rozlewający się olej mineralny czystym ręcznikiem papierowym.
      1. Zamiast używać strzykawki, zanurz tylny koniec pipety w oleju mineralnym i napełnij go kapilarnie. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w pipecie, należy utrzymywać nadciśnienie na strzykawce aż do całkowitego wyjęcia ze szklanej pipety.
         nuta: Do skutecznego przeszczepiania komórek MGE można użyć innych urządzeń. Każde urządzenie, które może dostarczyć objętość mniejszą lub zbliżoną do 100 nl, dobrze sprawdza się w tej procedurze.
   3. Następnie użyj sterylnego ręcznika papierowego lub dowolnego materiału chłonnego, z rogiem skręconym w drobny punkt, aby delikatnie usunąć nadmiar pożywki nad granulką komórek MGE. Ten etap koncentruje gęstość komórek, dzięki czemu można uzyskać mniejsze objętości iniekcji. Następnie użyj pipety o małej objętości (preferowany jest P2), aby powoli wyciągnąć osad komórkowy i rozcierać 1-2 razy przed przeniesieniem zawiesiny komórek na powierzchnię hydrofobową. Objętość powinna wynosić nieco poniżej 1 μl. Wsunąć końcówkę igły do zawiesiny kuwety i za pomocą napędu hydraulicznego wciągnąć zawiesinę do pipety.
   4. Znieczulić szczeniaka P1 przez hipotermię (zawinąć w lateksową rękawiczkę i położyć na lodzie na ~ 2-4 min). Sprawdź skuteczność znieczulenia szkodliwym bodźcem. Ściśnij skórę między palcami cienkimi kleszczami: szczenię powinno przestać reagować, jeśli zostanie uszczypnięte. Następnie umieść szczeniaka na formie, która znajduje się pod urządzeniem do wstrzykiwania, a następnie napnij skórę, odciągając skórę na głowie i zabezpieczając standardową taśmą laboratoryjną.
      nuta: Chociaż hipotermia jest bardzo skuteczna u nowonarodzonych myszy i powoduje niską śmiertelność, zabiegi muszą być wykonywane szybko, ponieważ młode zaczną wracać do zdrowia w mniej niż 10 minut. Ponadto 4 minuty na lodzie to górna granica tego, co można tolerować. Proszę próbować wywołać hipotermię tylko raz, jeśli potrzeba więcej czasu na wstrzyknięcia. Jeśli jednak szczenię wcześnie wyzdrowieje, najpierw pozwól mu w pełni wyzdrowieć, zanim ponownie wywołasz hipotermię. Co więcej, wywołaj hipotermię tylko raz jeszcze raz, aby wykonać zastrzyki. Szczenięta wyzdrowieją w ciągu 5-10 minut od hipotermii. Można to ułatwić, umieszczając szczenięta z miotem i mamą lub umieszczając szczenię na ciepłej powierzchni, aby mogło dojść do siebie.
   5. Za pomocą urządzenia stereotaktycznego umieść końcówkę szklanej pipety na powierzchni głowy szczeniaka, prostopadle do powierzchni głowy. Gdy pipeta styka się z głowicą, należy to uznać za wartość "0". Następnie wepchnij pipetę przez powierzchnię skóry i czaszki do kory mózgowej, a następnie włóż i wsuń pipetę ~ 2 razy przed zatrzymaniem. W celu optymalnego ukierunkowania komórek do kory nowej, iniekcje wykonuje się, gdy mikropipeta znajduje się na głębokości 0,1 mm. Jednak powinno to zostać zoptymalizowane przez użytkownika (patrz uwaga poniżej).
      nuta: Podczas gdy głębokość ta niezawodnie celuje w głębsze warstwy kory nowej za pomocą urządzeń opisanych powyżej, kilka głębokości powinno zostać przetestowanych i określonych empirycznie. Ponadto należy przetestować zakres głębokości w różnych pozycjach ogonowo-ogonowych i przyśrodkowo-bocznych, aby określić, jaka głębokość jest optymalna w każdym miejscu. Również początkowe nakłucie powinno być szybkie, ponieważ powolna penetracja kory nowej zmniejsza zdolność do czystej penetracji tkanki. Wypróbuj różne prędkości przy pierwszym uruchomieniu tej procedury, aby znaleźć to, co działa najlepiej. Ponadto, do testowania współrzędnych, nic nie zastąpi używania oznaczonych komórek, ponieważ barwniki nie są w stanie oznaczyć pozycji.
   6. Gdy igła znajdzie się na swoim miejscu, obróć urządzenie hydrauliczne, aby przesunąć tłok do szklanej pipety, wpychając określoną objętość zawiesiny komórek do kory mózgowej. Wstrzyknąć 50-70 jl na miejsce. Powtórz tę procedurę w 3-6 różnych miejscach na różnych poziomach rostralno-ogonowych, jeśli celem jest uzyskanie szerokiego rozmieszczenia komórek w całej korze nowej.
      nuta: Objętości 100 nl lub większe mogą powodować zmiany chorobowe i prowadzić do dużych skupisk wstrzykniętych komórek, które nie są w stanie skutecznie wyemigrować z miejsca wstrzyknięcia. W związku z tym mniejsze objętości iniekcji (~70 nl lub mniej) są optymalne, w większej liczbie miejsc, jeśli pozwala na to czas.
   7. Po zakończeniu wstrzyknięć usuń szczenię ze sceny i oznacz je (obcinanie palców u nóg jest niezawodnym sposobem późniejszej identyfikacji szczeniąt). Gdy szczenię wyzdrowieje i będzie w stanie samodzielnie się poruszać (następuje to w ciągu kilku minut od usunięcia go ze sceny), umieść je z powrotem z mamą i miotem.
      nuta: Ponieważ jest to procedura minimalnie inwazyjna, nie ma zabiegów pooperacyjnych, gdy szczenię swobodnie się porusza i jest ogrzane. Jednak szczenięta powinny być badane nie tylko po zabiegu, ale także następnego dnia, aby upewnić się, że nie mają oznak pogarszającego się stanu zdrowia.
   8. Przed rozpoczęciem procedury na następnym szczeniaku spryskaj obszar 70% etanolem, aby utrzymać sterylne miejsce pracy. Pozwolić młodym, którym wstrzyknięto implanty, rozwinąć się, a następnie ocenić tkankę na odpowiednim etapie rozwoju.

Tabela 1. Lista inwentarza odczynników i narzędzi.Spis dostępnych na rynku odczynników, w tym pożywki, narzędzia do preparacji, reprezentatywny sprzęt do przeszczepów i wektory DNA. (brak danych) Niedostępne lub niedostępne.

powiedział: powiedział: szt.

Odczynniki i sprzęt do przygotowania i transdukcji komórek MGE			Katalog #	firma
1)	Zmodyfikowany Orzeł Dulbecco, z wysokim poziomem glukozy		Numer katalogowy: 12491-015	Technologie życiowe
2)	Ciepło inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej		Numer katalogowy: 10437-077	Technologie życiowe
3)	Hanks zrównoważony roztwór soli (HBSS), bez wapnia i magnezu		Nr kat. 14170-112	Technologie życiowe
4)	1,5 ml probówek do mikrowirówek (lub innych probówek zbiorczych z pokrywkami)		3810X	Eppendorf International
5)	Polibrene		SC-134220 powiedział:	SantaCruz Biotechnologia
6)	Nóż kłujący prosty 22,5 ° (opcjonalnie)		REF 72-2201	Korporacja specjalizacji chirurgicznych
7)	szalka Petriego (10 cm), do preparacji tkanek		FB0875713	Fisher Naukowy
8)	2 szczypce z cienką końcówką, takie jak Dumont #5		Numer katalogowy: 11254-20	Doskonałe narzędzia naukowe
9)	37 °C inkubator do hodowli tkankowych z 5% wejściem CO2		Zobacz materiał C150	spoiwo
10)	Wirówka stołowa, która może obracać 1,5 ml probówek do mikrowirówek
11)	Dowolna pipeta P1000, która może być użyta do rozdrobnienia komórek.
12)	Kaptur poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2
Odczynniki i sprzęt do hodowli pierwotnych in vitro MGE			Katalog #	firma
1)	Szkiełka komorowe Lab-TekII z pokrywą, 8 dołków		154941	Rybak termiczny
2)	Poli-L-lizyna 0,1% wagowo-objętościowo		Zobacz materiał P8920	Sigma Aldrich
3)	Mysz Laminina, 0,5-2 mg/ml		23017-015	Technologie życiowe
4)	Podłoże neuropodstawowe		21103-049	Technologie życiowe
5)	B27 suplement wolny od surowicy		17504044	Technologie życiowe
6)	Glutamax, 100x zapas		Numer telefonu 35050-061	Technologie życiowe
7)	Penicylina-Streptomycyna, 100x zapas		Numer katalogowy: 15070-063	Technologie życiowe
8)	Glukoza, (przygotuj 25% roztwór w wodzie)		Silnik G5400	Sigma Aldrich
Odczynniki i sprzęt do przeszczepu komórek MGE			Katalog #	firma
1)	1 ml strzykawka		NUMER REF. 309602	BD, Becton Dickinson i spółka
2)	30 igła 1/2 G		305106	BD, Becton Dickinson i spółka
3)	Precyzyjny otwór do dostarczania 5 μl (w zestawie z tłokiem)		Numer katalogowy: 5-000-1005	Firma naukowa Drummond
4)	Parafilm		PM-999 (wersja angielska)	Polysciences, Inc.
5) **	Mikroskop stereoskopowy z wysięgnikiem		MZ6	Księga Leica
6) **	Cyfrowy tylko dla myszy instrument stereotaktyczny		51725D	Firma stoelting
7) **	Jednoosiowy precyzyjny mikromanipulator olejowo-hydrauliczny		MO-10	Narishige powiedział:
8)	Ukosowanie obrotowe z powłoką diamentową		nie dotyczy	Wyprodukowano we własnym zakresie
9)	Ściągacz do pipet igłowych		730	Instrumenty Kopf
10)	Olej mineralny		nie dotyczy	Każda apteka lub apteka
11)	Dowolna pipeta i końcówki, które mogą niezawodnie zmierzyć 1 μl objętości
	** To są modele, których używamy, ale wiele innych konfiguracji powinno działać
Opcjonalne odczynniki (do produkcji lentiwirusów)			Katalog #	firma
1)	25 mm, filtr 0,45 μm		09-719B	Fisher Naukowy
2)	Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe (25 x 89 mm)		344058	Beckman Coulter®
3)	Lipofektamina 2000	(Pojemność 1,5 ml)	11668019	Invitrogen
Inne dostępne na rynku materiały eksploatacyjne			Katalog #	firma
1)	kodowanie plazmidu pMDLg/pRRE gag/pol		Numer katalogowy: 12251	Addgene powiedział:
2)	kodowanie plazmidu pRSV-Rev Rev		Numer katalogowy: 12253	Addgene powiedział:
3)	pMD2.G kodowanie plazmidu VSVG		Numer katalogowy: 12259	Addgene powiedział:
4)	pAAV-Flex-GFP		Numer katalogowy: 28304	Addgene powiedział:

Wyniki

Rycina 1. Reprezentatywna procedura preparacji tkanki E13.5 MGE. Przykładowa sekcja tkanki MGE do hodowli pierwotnych lub przeszczepów. (A-E) Obrazy sekcji mózgu E13.5 i schematy (A'-E') w celu podkreślenia struktur i ważnych etapów procedury. (A, A') Reprezentatywny mózg E13.5 widziany od strony brzusznej. Czerwona linia oznacza pierwsze wykonane c...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki i sprzęt do przeszczepu komórek MGE
1 ml strzykawka	REF 309602	BD, Becton Dickinson i spółka
Igła o rozmiarze 301/2	305106	BD, Becton Dickinson i spółka
Precyzyjny otwór o pojemności 5 μl (w zestawie z tłokiem)	5-000-1005	Firma naukowa Drummond
Parafilm	PM-999	Polysciences, Inc.
Mikroskop stereoskopowy z wysięgnikiem **	MZ6	Leica
Cyfrowy tylko dla myszy instrument stereotaktyczny **	51725D	Firma stoelting
Jednoosiowy mikromanipulator olejowo-hydrauliczny **	MO-10	Narishige
Ukosowarka obrotowa z powłoką diamentową	n.a.	Wykonane w domu
Ściągacz do pipet igłowych	730	Kopf instruments
Olej mineralny	n.a.	Dowolna apteka lub apteka
Dowolna pipeta i końcówki, które mogą niezawodnie zmierzyć 1 μl objętości
** To są konkretne modele, których używamy, ale wiele innych konfiguracji powinno działać
Opcjonalne odczynniki (do produkcji lentiwirusów)
Filtr 25 mm, 0,45 μm	09-719B	Fisher Scientific
Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (rozmiar 1,5 ml)	11668019	Invitrogen
Inne dostępne na rynku materiały eksploatacyjne
pMDLg/pRRE kodowanie plazmidu gag/pol	12251	Addgene
kodowanie plazmidu pRSV-Rev Rev	12253	Addgene
pMD2.G kodowanie plazmidu VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene