$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zabieg przedoperacyjny
- Przed rozpoczęciem operacji przetrzyj wszystko 70% etanolem, aby utrzymać sterylne warunki. Zalecane jest wspomaganie termiczne za pomocą poduszki grzewczej.
- Znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie wodzianu chloralu (400 mg/kg). Potwierdź znieczulenie, wykonując szczypanie palca u nogi. Zaleca się stosowanie meloksykamu SR podczas indukcji i buprenorfiny po wyzdrowieniu BID (bis in die, dwa razy dziennie) przez co najmniej 24 godziny.
- Ogol włosy maszynką do strzyżenia chirurgicznego. Zamocuj mysz w adapterze myszy i noworodka dla szczurów za pomocą pasków na uszy i zacisku na nos.
UWAGA: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby upewnić się, że głowa myszy jest zabezpieczona i nie porusza się obok siebie.
- Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
2. Chirurgia stereotaktyczna do implantacji kaniuli prowadzącej
- Ustaw adapter myszy i noworodka szczura na aparacie stereotaktycznym. Wykonaj nacięcie strzałkowo na skórze nad czaszką za pomocą skalpela. Zetrzyj krew i tkankę łączną z czaszki za pomocą wilgotnego bawełnianego wacika.
- Określ współrzędne dla obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą atlasu mózgu. Przed rozpoczęciem pomiarów upewnij się, że linia środkowa jest prosta, aby wiertło można było przesuwać od AP do połowy i przez cały czas pozostawać na szwie linii środkowej.
UWAGA: Ten artykuł używa współrzędnych (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,5 mm, D/V: -1,2 mm, 12 stopni) do celowania w tylny hipokamp.
- Czaszka poziomu A-P
- Przymocuj wiertło do manipulatora ramy stereotaktycznej. Opuść wiertło, aż delikatnie dotknie lambdy i zapisz jego współrzędną brzuszną. Powtórz tę procedurę dla bregmy.
UWAGA: Gdy czaszka jest wyrównana, pionowy pomiar bregmy jest równy wymiarowi lambdy. Jeśli nie, wyreguluj wysokość nosa clamp odpowiednio. Po wyrównaniu czaszki zapisz przednią/tylną, boczną współrzędną bregmy.
- Poziom czaszki lewo-prawo
- Przesuń wiertło z bregmy na współrzędną (przednio-tylna [A/P]: -3,1 mm, przyśrodkowo-boczna [M/L]: +2,0 mm), opuść wiertło do czaszki i zapisz współrzędną pionową. Następnie powtórz tę procedurę dla współrzędnych (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,0 mm).
UWAGA: Jeśli czaszka jest wyrównana, te pionowe pomiary dwóch równoodległych punktów od linii środkowej są równe. Jeśli nie, wyreguluj wysokość nauszników.
- Ostrożnie wywierć otwór na zadziory w współrzędnej docelowej (A/P: -3.1 mm, M/L: -2.5 mm), aby wszczepić kaniulę prowadzącą. Jeśli średnica otworu w zadziorze nie jest wystarczająco duża, aby można było wszczepić kaniulę prowadzącą, wywierć kolejny otwór, który zachodzi na pierwszy. Wywierć kolejny otwór w prawej (po przeciwnej stronie) kości ciemieniowej i włóż śrubę kostną, która pomaga zabezpieczyć cement dentystyczny w 1.10 (patrz Rysunek 1B).
- Wytnij okrągły element blokujący z tylnej strony pokrywki probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą żyletki i wykonaj "koronę". Korona ta służy do zapobiegania rozprzestrzenianiu się cementu dentystycznego na skórę. Umieść go na czaszce tak, aby otwory w zadziorach wykonane w kroku 2.5 pozostały w okręgu (patrz Rysunek 1).
- Skonfiguruj zestaw stereotaktyczny, umieszczając kaniulę prowadzącą na krótszym ramieniu adaptera stereotaktycznego i przymocuj go za pomocą nakrętki kołpakowej. Ustaw dłuższe ramię adaptera stereotaktycznego na zacisku elektrody. Przymocuj go do manipulatora aparatu stereotaktycznego (patrz Rysunek 1A).
- Obróć zespół stereotax grzbietowo-brzuszny (D-V) na ramieniu manipulatora o 12 stopni (patrz Rysunek 1B). Przesunąć kaniulę prowadzącą do otworu zadziorowego wykonanego w 1.6. Powoli włóż kaniulę prowadzącą do mózgu, obniżając ją o 1,2 mm.
UWAGA: Kąt sondy jest specyficzny dla hipokampa; Inne obszary mogą wymagać innych kątów lub w ogóle nie wymagać kąta. Zapoznaj się z atlasem mózgu, aby uzyskać dokładne współrzędne. Osusz powierzchnię czaszki, ponieważ w przeciwnym razie cement nie będzie się przyklejał, a cementowa nasadka może się przemieścić
- Dodaj cement dentystyczny do korony, aby całkowicie pokryć zarówno metalową część kaniuli prowadzącej, jak i śrubę kostną na tyle, aby je zabezpieczyć. Nałóż dodatkowy cement dentystyczny, jeśli odsłonięta jest część czaszki.
- Poczekaj, aż cement dentystyczny całkowicie wyschnie (~12-20 min). Wyjmij adapter stereotaktyczny z elektrody clamp. Odkręć nakrętkę kołpakową i zastąp adapter stereotaktyczny atrapą sondy i dokręć nakrętkę kołpakową.
- Uwolnij mysz od aparatu stereotaktycznego i umieść ją samą w osobnej klatce.
UWAGA: Mysz nie powinna być pozostawiona bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Sprawdzaj mysz codziennie, aż do dnia mikrodializy. Mysz otrzymuje niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), takie jak karprofen, jeśli wydaje się, że odczuwa ból. Odczekanie 2 tygodni jest konieczne w przypadku badań snu i czuwania, aby mysz przyzwyczaiła się do nowego środowiska, ale inne rodzaje badań mogą wymagać krótszych okresów rekonwalescencji (e.g. 1-2 dni).
3. Konfiguracja mikrodializy
- Kontrola jakości sond: Napełnij jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml wodą destylowaną i podłącz ją do wylotu (krótszego portu) sondy za pomocą rurki byton. Zakryj palcami otwory wentylacyjne i delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aby wlać wodę do sondy. Sprawdź, czy z wlotu sondy wypływa woda i czy nie ma wycieków na powierzchni membrany do mikrodializy.
- Aktywacja sond: Zanurz membrany sondy w etanolu (70-100%) na dwie sekundy. Następnie ponownie wlej wodę destylowaną do sondy za pomocą strzykawki.
- Przygotowanie buforu perfuzyjnego: Aby uniknąć przywierania cząsteczek docelowych do przewodów, dodać BSA, rozcieńczając 30% roztwór BSA do 4% sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF: 1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 122 mM NaCl, pH = 7,35), który ściśle odpowiada stężeniu elektrolitu w płynie mózgowo-rdzeniowym, bezpośrednio przed użyciem. Przefiltrować bufor perfuzyjny przez strzykawkowy filtr o wielkości porów 0,1 μm.
UWAGA: 4% albumina surowicy bydlęcej (BSA) poprawia regenerację białek klejących, ale może poważnie ograniczyć dostarczanie związków, szczególnie w przypadku związków, które mają wysokie wiązanie BSA. Jest to jedna z zalet stosowania w niektórych przypadkach niższego stężenia BSA (np. 0,15%). Należy pamiętać, że BSA może bardzo łatwo się agregować, gdy jest mieszany przez wir lub płytkę mieszającą. Agregaty te mogą zatykać sondy lub pory membranowe. Zachowaj ostrożność podczas przygotowywania rozwiązania BSA, aby ograniczyć tę agregację
- Przygotuj dwie oddzielne linie dla wlotu i wylotu (patrz Rysunek 1C) i połącz obie linie za pomocą igły łączącej. Napełnij jednorazową strzykawkę o pojemności 3 ml wypełnioną buforem perfuzyjnym i połącz ją z końcówką wlotową rurki za pomocą tępej igły. Napełnij całą rurkę buforem perfuzyjnym, uruchamiając pompę strzykawkową.
- Zatrzymaj pompę strzykawkową i wymień igłę łączącą przewód dolotowy i wylotowy na aktywowaną sondę do mikrodializy z kroku 3.3 (patrz Rysunek 1C). Przed tą wymianą załóż nakrętkę kołpakową na sondę.
- Zamontuj rurę rolkową w rurze wylotowej pompy rolkowej. Uruchomić pompę strzykawkową przy 10 μl/min, a następnie pompę rolkową przy nieco wolniejszym natężeniu przepływu (9,5-9,8 μl/min). Upewnij się, że usunąłeś wszystkie pęcherzyki powietrza z całego przewodu, co może mieć wpływ na odzyskiwanie, gdy dostaną się do sondy.
- Znieczul mysz z kroku 1.12 w taki sam sposób, jak w kroku 1.2. Załóż obrożę na mysz na jej szyję. Zdejmij nakrętkę kołpakową i atrapę sondy i powoli włóż sondę do mikrodializy z 3.4 przez kaniulę prowadzącą i dokręć nakrętkę kołpakową.
- Umieść mysz w klatce podłączonej do systemu swobodnego ruchu i przywiąż mysz do obroży. Kontynuuj pracę zarówno pompy strzykawkowej, jak i pompy rolkowej ze wskazanym natężeniem przepływu w kroku 3.5 przez co najmniej 1 godzinę.
UWAGA: Aby uzyskać ISF od obudzonych zwierząt, ten artykuł wykorzystuje system swobodnego poruszania się, w którym klatka sama reaguje na ruch zwierzęcia, aby zapobiec skręcaniu się rurek. Alternatywnie można również zastosować krętliki do płynów dostępne w różnych firmach.
- Najpierw zatrzymać pompę rolkową, a następnie pompę strzykawkową. Ustaw żądane natężenie przepływu. Pompa strzykawkowa powinna pracować o 20% szybciej niż pompa rolkowa.
UWAGA: Na przykład, jeśli pracujesz z prędkością 1 μL/min, uruchom pompę strzykawkową z prędkością 1,2 μL/min. Optymalne natężenie przepływu należy określić empirycznie dla każdej cząsteczki.
- Pobieranie próbek ISF: umieścić wolny koniec rurki wylotowej na chłodzonym kolektorze frakcji.
UWAGA: Odpowiednia objętość próbki różni się w zależności od testów użytych do analizy.
- Po zakończeniu eksperymentu wyjmij sondę. (W razie potrzeby znieczulij mysz).Odzyskaj dane za pomocą myszy w taki sam sposób, jak w kroku 2.11. Analizuj pobrany ISF za pomocą metod takich jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) lub test immunoenzymatyczny (ELISA).
- Aby umyć cały przewód po mikrodializie, ponownie podłącz rurki dolotowe i wylotowe, zastępując sondę igłą przyłączeniową i wlej rozcieńczony wybielacz do całej rurki, a następnie przepłucz ją wodą. Wysuszyć i przechowywać do wielokrotnego użytku.
UWAGA: Inne typy węży są dopuszczalne, jednak BSA w buforze perfuzyjnym może zatkać rurki o małej średnicy, dlatego te rurki są uważane za jednorazowego użytku. Rurki mogą być zużyte lub zatkane po wielokrotnym użyciu, więc przed użyciem upewnij się, że natężenie przepływu jest stałe.
