1. Fluorescencyjne znakowanie komórek
UWAGA: Oznacz linie komórkowe glejaka i mikrogleju barwnikami fluorescencyjnymi 9. Alternatywnie można wygenerować linie komórkowe, które konstytutywnie wyrażają białka fluorescencyjne, takie jak GFP/RFP.
- Umieść komórki na płytce 6-dołkowej tak, aby w dniu barwienia zlewały się w 70 - 80%. W przypadku mysiego glejaka linii komórkowej GL261 i ludzkiej linii komórkowej glejaka U87, płytka 1 x 10 x 10 6 i 1,5 x 10 6 na 6 cm szalce 24 godziny przed barwieniem.
- Przygotować roztwór barwnika barwienia komórek fluorescencyjnych w DMSO (sultlenek dimetylu) i dodać barwnik 5 μM do pożywki, pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) lub pożywki wolnej od surowicy makrofagów (MSFM), dobrze zawirować.
- Inkubować komórki z barwnikiem przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
- Usuń pożywkę zawierającą barwnik i dodaj nową pożywkę (RPMI lub MSFM) do komórek.
- Inkubuj komórki przez 30 minut. Uwaga: Komórki są teraz wybarwione i gotowe do użycia w eksperymencie.
2. Test inwazji "3D" osadzający glejaka i makrofagi/mikroglej w matrycy
- Rozmrozić matrycę w temperaturze 4 °C przez noc. Wykonaj wszystkie dalsze manipulacje za pomocą matrycy na lodzie w masce.
- Przygotować matrycę o stężeniu 10 mg/ml w pożywce (MSFM lub RPMI) z 0,3% BSA na lodzie.
UWAGA: Stężenie podstawowe w matrycy wynosi zazwyczaj około 15 mg/ml.
- Aby przygotować komórki (oznaczone w kroku 1) do zawiesiny w matrycy, należy usunąć pożywkę z komórek przez aspirację. Umyj komórki na naczyniu 2 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)/PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami). Dodać 500 μl 2 mM EDTA/PBS do komórek i inkubować przez 5 - 10 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
- Zawiesić komórki w 5 ml pożywki zawierającej 0,3% BSA.
- Wirować przez 5 minut przy 120 x g.
- Odessać supernatant z osadu. Zawiesić osad w pożywce/0,3% BSA tak, aby stężenie komórek było równe 1 x 106 komórek/ml. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.
- Dodaj 1,5 x 105 komórek GL261 (w 150 μl) + 5 x 104 komórek mikrogleju (w 50 μl) do probówki mikropęcherzykowej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 2 x 105 komórek GL261 (200 μl) do oddzielnej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
UWAGA: Same komórki GL261 bez mikrogleju służą jako kontrola.
- Wiruj komórki w mikrofudze przez 5 minut w temperaturze 120 x g.
- Zawieś komórki w zimnej matrycy o objętości 200 μl na lodzie.
- Umieść 50 μl (50 000 komórek) na środku górnej komory wkładu komory o wielkości porów 8 μM.
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby nastąpiła polimeryzacja.
- Dodać 200 μl pożywki bez surowicy do górnej komory i 700 μl pożywki zawierającej surowicę do dolnej studzienki.
- Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin.
- Po inkubacji usuń komórki z górnej części komory przez delikatne aspiracje i napraw komory, umieszczając je w 3,7% formaldehydzie w PBS. Pozostawić komory do pozostania w utrwalaczu przez 15 minut w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C). Usunąć utrwalacz przez delikatne zassanie i zastąpić 500 μl 1x PBS. Przejdź do sekcji 4 w celu analizy obrazu.
