Stymulacja neuronów czuciowych zwoju korzenia grzbietowego za pomocą agonisty receptora neuropeptydowego

Streszczenie

Źródło: Lin, Y., i wsp., Izolacja zwojów korzenia grzbietowego i hodowla pierwotna w celu zbadania uwalniania neuroprzekaźników. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje wykorzystanie transfekowanych komórek zwojowych korzenia grzbietowego do badania uwalniania neuroprzekaźników poprzez stymulację ich agonistą receptora neuropeptydowego.

Protokół

1. Uwalnianie neuroprzekaźników z pierwotnych komórek DRG

1. W dniu 6, po posianiu komórek (72 godziny po transfekcji siRNA), zmień pożywkę hodowlaną na 200 μl pożywki bez surowicy i inkubuj komórki w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
2. Dodać 1 μl substancji chemicznej (substancji chemicznych) do stymulacji i delikatnie wymieszać pożywkę przez pipetowanie. Inkubować naczynie w inkubatorze CO₂ o temperaturze 37 °C przez wyznaczony czas.
   UWAGA: W tym artykule hodowane komórki stymulowano agonistą NPFFR2, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg- Phe-NH2, 5 nmol), przez 1 h.
3. Zebrać pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego i odwirować przy 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich zawieszonych zanieczyszczeń.
4. Zebrać supernatant z wirówki i w razie potrzeby rozcieńczyć próbki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Następnie użyj zestawów do testów immunoenzymatycznych (EIA), aby oznaczyć poziomy neuroprzekaźników.
   UWAGA: Tutaj supernatanty rozcieńczono w stosunku 1:100 przed analizą poziomu CGRP. Supernatant nie był rozcieńczany przed analizą poziomu SP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	Pożywka hodowlana
Zrównoważony roztwór soli Hanka	Invitrogen	14170-112	Pożywka hodowlana
Pipeta Pasteura	Hilgenberg	3150102	Tryturacja komórek
dNPA	Synteza genemów	n/a	Agonista NPFFR2