Badanie migracji limfocytów przez monowarstwę komórek śródbłonka mikronaczyniowego

Streszczenie

Źródło: Schulte-Mecklenbeck, A., i inni., Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu Model in vitro { ludzkiej bariery krew-mózg. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia eksperymentalne badanie transmigracji limfocytów przez model śródbłonka bariery krew-mózg (BBB). Monowarstwa komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu (HBMEC) jest generowana in vitro, a komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zawierające limfocyty są dodawane do monowarstwy. Komórki są następnie inkubowane, aby umożliwić transmigrację limfocytów, a migrowane komórki są oznaczane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej.

Protokół

1. Przygotowanie wkładek do hodowli komórkowych

1. Powlekanie wkładek do hodowli komórkowych
   Ważna uwaga: Unikaj dotykania błony wkładek do hodowli komórkowych.
   1. Dodaj 100 μl roztworu fibronektyny do każdej wkładki do hodowli komórkowej (Rysunek 1A) i jednego dołka 96-dołkowej płytki z płaskim dnem (studzienka kontroli optycznej). Inkubować przez co najmniej 3 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji odessać roztwór fibronektyny.
   2. Dodać 100 μl zawiesiny HBMEC do wkładek do hodowli komórkowych i studzienki kontroli optycznej. Dodać 600 μl pożywki średnio-bazalnej komórek śródbłonka (ECM-b) do dolnego przedziału wkładek do hodowli komórkowych. Inkubować przez 3 - 4 dni w temperaturze 37 °C / 5% CO₂ aż do osiągnięcia integralności bariery (Rysunek 1B), sprawdzić wzrost komórek za pomocą mikroskopowej oceny HBMEC w studzience kontroli optycznej.
      Uwaga: Wzrost komórek powyżej czterech dni nie jest zalecany.

2. Test migracji

1. Przygotowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC).
   1. Dodać 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) do 15 ml probówki wirówkowej i dodać 200 μl suplementu B27. Liczyć PBMC i odwirować komórki w stężeniu 300 x g przez 5 min. Ponownie zawiesić PBMC do końcowego stężenia 5 x 10⁶ komórek/mL RPMI/B27.
2. Przygotowanie testu migracji
   1. Odessać pożywkę z dolnej komory, a następnie górną komorę wkładek do hodowli komórkowych zawierających zlewające się monowarstwy HBMEC (Rysunek 1A). Na dawcę dodać po 100 μl zawiesiny PBMC do wkładek do hodowli komórkowych, a także do jednego dołka na 24-dołkowej płytce na ( in vitro kontrola).
   2. Dodać 600 μL RPMI/B27 do dolnej komory wkładek do hodowli komórkowych i 500 μL do PBMC kontroli in vitro i inkubować 6 godzin w temperaturze 37 °C / 5% CO_2.
3. Odławianie migrowanych PBMC
   1. Wyjąć wkładkę do hodowli komórkowej za pomocą kleszczy i ostrożnie przepłukać dno 400 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), nie dotykając membrany. Wyrzuć wkładkę do hodowli komórkowej.
   2. Dodać 20 μl fluorosfer zliczających przepływ (około 1,000 kulek/μl) do dolnej komory wkładki do hodowli komórkowej, a także do kontroli in vitro i dobrze wymieszać. Przenieść 1 ml otrzymanej zawiesiny PBMC do probówek do cytometrii przepływowej.

3. Cytometria przepływowa

1. Przygotowanie próbki
   1. Odwirować PBMC przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Przygotować roztwór przeciwciała, dodając przeciwciała sprzężone z fluorochromem do 100 μl buforu cytometrii przepływowej (PBS/1% albuminy surowicy bydlęcej [BSA]/2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego [EDTA]) na próbkę. Dla wyników przedstawionych poniżej użyto 1 μL CD4-FITC (klaster różnicowania izotiocyjanianu 4-fluoresceiny), 1 μL CD3-PerCP/Cy5,5 (białko chlorofilu perydyny/cyjanina 5,5), 1 μl CD56-PC7 (cyjanina fikoerytryny 7), 1 μl CD8-A700 (Alexa fluor 700) i 1 μl CD16-A750 (Alexa fluor 750).
   3. Ponownie zawiesić PBMC w 100 μl roztworu przeciwciała i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Dodać 250 μl buforu do cytometrii przepływowej i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.

Wyniki

Rycina 1: Zróżnicowana migracja podzbiorów komórek NK przez monowarstwy HBMEC bez stanu zapalnego i zapalnego. A. Zdjęcie wkładek transwell (po lewej) i ilustracja układu eksperymentalnego (po prawej). B. Walidacja funkcji bariery HBMEC. Po lewej: barwienie immunohistochemiczne cząsteczki ścisłego połączenia ZO-1 przy użyciu króliczej anty-ludzkiej zonuli occludens-1 (ZO-1, abcam, 1:...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS	Gibco	14190-094	bez CaCl2 lub MgCl2
Fibronektyna 1mg/mL	Sigma	F1141-5MG	z osocza bydlęcego
HBMEC	ScienCell	1000
HBMEC	Pelobiotech	PB-H-6023
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicylina/Streptomycyna	ScienCell	1001-b
Suplement na wzrost komórek śródbłonka	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	przezroczysty, średnica 6,5 mm, wielkość porów 3,0 μm
96-dołkowa płaska płyta denna	Corning	3596
B27	Gibco	17504-044	50x skoncentrowany
Płytka 48-dołkowa	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Liczba przepływów Fluorosfery	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
CD3-PerCP/Cy5.5	Legenda biologiczna	300430	klon UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	klon N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	klon 3G8
CD4-FITC	Legenda biologiczna	300506	klon RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	klon B9.11