1. Konfiguracja i wykonywanie pomiaru przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej (TEER)
- Umieść 24-dołkowy moduł przyrządu do przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) pod okapem z przepływem laminarnym. Zdejmij pokrywki i umieść wkładki z pierwotnymi komórkami mikronaczyniowego śródbłonka mózgu myszy (MBMEC) w instrumencie za pomocą kleszczy.
- Odpipetować 810 μl świeżego podłoża do dolnej komory studzienek modułu: dodać ostrożnie między wkładkę a ściankę studzienki modułu.
- Zamknij pokrywy i umieść instrument w inkubatorze. Podłącz przyrząd do komputera; Włącz kontroler przyrządu i otwórz oprogramowanie.
- Wybierz "nowy pomiar" w wyskakującym okienku. Zaznacz pola "pokaż TEER" i "pokaż Ccl"; Następnie naciśnij "Start". Po zakończeniu pierwszego pomiaru wybierz "sprawdź wszystkie dołki" w zakładce "wyniki", aby zobaczyć wszystkie wartości TEER i pojemności warstwy ogniw (Ccl).
- Zapisz plik: Plik>Zapisz jako> nazwę swojego pliku".
UWAGA: Ponieważ TEER i Ccl są stale mierzone w sposób zautomatyzowany, monitoruj ich wartości przez okres od trzech do pięciu dni. Zmiana pożywki nie jest konieczna, chyba że żywotność komórek jest nieoptymalna, co widać po braku wzrostu TEER.
- Wybierz punkt czasowy do kohodowli MBMEC z limfocytami T, gdy Ccl jest stabilny i niższy niż 1 μF/cm2, a TEER osiągnął maksymalny poziom.
- Dokładnie sprawdź bezwzględne wartości TEER i Ccl i wyklucz odwierty, w których MBMEC nie rozwinęły wystarczająco zlewających się monowarstw, odznaczając takie studnie.
- Pogrupuj pozostałe studnie: kliknij prawym przyciskiem myszy na studnię i wybierz "dodaj studnię do nowej średniej studni". Nazwij go w wyskakującym okienku; Zrób to samo dla wszystkich pojedynczych studzienek, które mają zostać zgrupowane.
- Sprawdź wszystkie średnie studzienki, aby potwierdzić, że wszystkie mają te same warunki początkowe przed kokulturą. Jeśli niektóre z nich mają znacząco różne bezwzględne wartości TEER lub nachylenia TEER lub błędy standardowe są zbyt duże, należy ponownie wykonać grupowanie.
NOTATKA: Optymalne grupowanie studni zapewnia minimalne różnice w wartościach TEER w obrębie i pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
- W zakładce "eksperyment" naciśnij "pauza", odłącz instrument i wyjmij go z inkubatora. Zdejmij pokrywki pod okapem z przepływem laminarnym.
- Przygotuj wstępnie aktywowane i/lub nieuszkodzone limfocyty T, ze specyficznymi cytokinami, przeciwciałami lub innymi substancjami lub bez nich, zgodnie z potrzebami. Na przykład, zmieszać oczyszczone natywne/nisko endotoksynowe (NA/LE) szczurze przeciwciało przeciwko mysiemu interferonowi-gamma (IFN-γ) (klon XGM1.2) z przygotowanymi limfocytami T w ilości 20 μg/ml na studzienkę instrumentu TEER.
UWAGA: Jeśli stosowane są substancje takie jak inhibitor granzymu B, dodaje się je do hodowli limfocytów T na początku stymulacji limfocytów T: e.g., Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) miesza się z izolowanymi limfocytami T w końcowym stężeniu 10 μM w dimetylosulfotlenku (DMSO).
- Wyjmij część nośnika z wkładu (górna komora studzienki). Przykład: ostrożnie odpipetować 150 μl (należy unikać usuwania całego medium, ponieważ mogłoby to zakłócić działanie monowarstwy MBMEC).
- Dodać limfocyty T do MBMEC, ostrożnie pipetując 150 μl pożywki zawierającej 2 x 105 komórek/wstaw.
UWAGA: Podczas zbierania wstępnie aktywowanych limfocytów T, licz tylko komórki wolne od trypana niebieskiego.
- Zamknij pokrywy i umieść instrument z powrotem w inkubatorze. Podłącz ponownie przyrząd i naciśnij "wznów pomiar". Po 24 godzinach naciśnij 'stop' w zakładce 'eksperyment' i zapisz plik (File>Save).
