Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Perfuzja i przetwarzanie tkanek
- Znieczulenie myszy za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego z ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg). Ściśnij palce u stóp, aby potwierdzić brak odpowiedzi, zanim przejdziesz dalej.
- Perfuzja przezsercowa z ~ 50 ml lodowatego 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS), a następnie 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PB).
UWAGA: PFA jest toksyczny. Podczas pracy z PFA należy stosować środki ochrony osobistej (PPE).
- Wyjąć mózgi i zanurzyć je w 4% PFA w 0,1 M PB w temperaturze 4 °C na 24 godziny w celu późniejszego utrwalenia. Umyć za pomocą DPBS 3x.
- Zmienić na 15% roztwór sacharozy w 0,1 DPBS na noc, a następnie 30% roztwór sacharozy w 0,1 M DPBS przez kolejne 48 godzin w temperaturze 4 °C.
- Usunąć tkankę z roztworu sacharozy i zamrozić w komorze kriotomicznej nastawionej na temperaturę -20 °C. Zamrożone próbki można przechowywać w szczelnie zamkniętych probówkach w temperaturze -80 °C do czasu ich podziału.
- Osadź tkanki w podłożu do zatapiania w optymalnej temperaturze cięcia (patrz Tabela materiałów) i zamontuj na tarczy z próbką. Wytnij seryjne odcinki o grubości 30 μm w płaszczyźnie koronalnej za pomocą kriotomu i zbierz wszystkie skrawki następnie na 24-dołkowych płytkach hodowlanych wypełnionych roztworem krioprotektantu (30% glicerol, 30% glikol etylenowy, 40% DPBS; Rysunek 1A–C). Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Grubsze sekcje (np. 50 μm) są preferowane, jeśli jest to możliwe. Upewnij się, że sekcje są utrzymane w kolejności cięcia i że wszystkie sekcje są całkowicie w krioprotektantach. Płytka 96-dołkowa może być używana jako alternatywa dla płytek 24-dołkowych do pobierania skrawków.
- Przykryj studzienki uszczelniaczem do płyt, aby zapobiec parowaniu i wysychaniu. Przechowywać płytki w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Skrawki przechowywane w temperaturze -20 °C są stabilne przez kilka miesięcy dla immunohistochemii acetylotransferazy choliny (ChAT).
2. Systematyczny wybór sekcji dla IHC
UWAGA: Należy przeprowadzić badanie pilotażowe, aby poznać całkowitą liczbę sekcji wymaganych do osiągnięcia akceptowalnego współczynnika błędu (CE). Wartość CE jest wyrazem całkowitego poziomu błędu w procedurze pobierania próbek. Najniższa wartość oznacza minimalny błąd, a wartość CE niższa niż 0,1 jest uważana za akceptowalną przez użyte tutaj oprogramowanie (patrz tabela materiałów).
- Zidentyfikuj pierwszą i ostatnią sekcję dla każdego mózgu, porównując cechy morfologiczne ze standardowym atlasem mózgu myszy, takim jak Franklin i Paxinos. Jądro podstawne Meynerta lub NBM zaczyna się od -0,0 mm i kończy na -1,6 mm. W związku z tym około 50 sekcji zawiera NBM. Całkowita liczba sekcji jest jednym z parametrów wymaganych podczas stereologii. Wybór co8-tej sekcji (SSF = 1/8) dał w sumie 6-7 sekcji do analizy i dał akceptowalne CE zarówno dla oszacowania objętości, jak i oszacowania długości włókien w naszym badaniu pilotażowym.
- Rozpocznij losowo od jednej z pierwszych ośmiu sekcji, a następnie systematycznie pobieraj próbki co 8. sekcję, aż do ostatniej tylnej sekcji zawierającej NBM (ryc. 1C).
3. Immunohistochemia
- Przenieś kriokonserwowane skrawki do temperatury pokojowej w krioprotektantze, a następnie 0,1 M buforu fosforanowego (PB) na płytkach 6-dołkowych.
- Umyć 3x w PB.
- Inkubować w 0,3% H2O2 w metanolu przez 15 min.
- Umyć 3x w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS).
- Inkubować w 0,25% Triton X-100 w TBS przez 30 min.
- Blok z 10% normalną surowicą bydlęcą (NBS) w 0,1% Triton X-100 w TBS przez 30 min.
- Inkubować z rozcieńczeniem 1:1 000 kozich przeciwciał pierwotnych przeciwko ludzkiemu ChAT (patrz tabela materiałów) w TBS z 0,1% Triton X-100 i 1% NBS przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
- Prać 3x w TBS w temperaturze pokojowej. Wykonaj dalszą inkubację i mycie w temperaturze pokojowej.
- Inkubować z biotynylowanym bydlęcym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko kozom (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę.
- Umyć 3x w TBS.
- Inkubować z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza (patrz tabela materiałów).
- Umyć 3x w TBS.
- Opracowywać przy użyciu ulepszonego roztworu substratu peroksydazy DAB (patrz tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta.
UWAGA: DAB jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy. Jest toksyczny przez kontakt i wdychanie. Używaj środków ochrony osobistej podczas pracy z DAB.
- Umyj sekcję kilka razy wodą destylowaną i utrzymuj w pH Tris = 7,6.
- Zamontuj sekcje na żelowatych szkiełkach. Wszystkie wycinki z jednej tkanki można umieścić na tym samym szkiełku. Wysuszyć sekcje na powietrzu, odwodnić 2x po 5 minut za pomocą 70%, 90%, 95% i 100% etanolu, a następnie oczyścić sekcje dwoma 10-minutowymi płukankami ksylenu. Szkiełko nakrywkowe należy wykonać za pomocą środka montażowego (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Czas przetwarzania odwadniania i oczyszczania wpływa na grubość sekcji. Dlatego dla wszystkich sekcji należy stosować te same warunki. W niniejszym badaniu średnia wartość dla grubości końcowej wynosiła 21,11 ± 0,45 μm.
- Utrzymuj sekcje w dygestoriach do wyschnięcia. Suche sekcje są gotowe do badania stereologicznego.
