$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Wychwyt synaptosomalnej dopaminy
UWAGA: Ten protokół służy do równoległej oceny dwóch mózgów, ale może być również z powodzeniem używany do przeprowadzania eksperymentów z wychwytem synaptosomalnej dopaminy (DA) z czterema mózgami równolegle.
- Preparaty
- Oznaczyć 48 mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml w tabeli 1 (po 24 dla każdego mózgu). Użyj różnych kolorów dla probówek należących do każdego mózgu, aby zapobiec pomyleniu próbek.
- Oznacz 51 probówek scyntylacyjnych #1-51.
- Umieścić sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) na lodzie. Zostanie to wykorzystane do utrzymania mózgów w chłodzie.
- Włączyć wirówkę, aby umożliwić jej wstępne ostygnięcie do temperatury 4 °C.
- Wstępnie zważyć dwie probówki do mikrowirówek, aby uzyskać dokładną masę tkanki podczas przygotowania synaptosomalnego (sekcja 2.6).
- Przygotować bufor homogenizacyjny, mieszając 4 mM HEPES i 0,32 M sacharozy. Dostosuj pH do 7,4 i trzymaj na lodzie.
nuta: Bufor homogenizacyjny może być przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C i rozmrożony w dniu doświadczenia.
- Przygotować bufor wychwytowy, łącząc następujące elementy: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mMMgSO4, 1 mM kwas askorbinowy (0,194 g/L), 5 mM D-glukoza (0,991 g/L). Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą NaOH (prowadzi do stężenia sodu około 130 mM) i przechowywać na lodzie.
nuta: Dla 2 mózgów przygotuj 1500 ml buforu wychwytowego. Przygotować bufor wychwytowy jako 10-krotny roztwór podstawowy bez kwasu askorbinowego i glukozy, utrzymywany w temperaturze 4 °C. Przygotować 1x roztwór roboczy świeżo w ciągu dnia, uzupełniając kwasem askorbinowym i glukozą. Dostosuj pH za pomocą NaOH do 7,4.
- Przygotować bufor wychwytowy + ligand, łącząc następujące elementy: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mMMgSO4, 1 mM kwas askorbinowy (0,194 g/L), 5 mM D-glukoza (0,991 g/L), 1 μM pargilina, 100 nM dezypramina, 10 nM inhibitor katechol-O-metylotransferazy (COMT). Doprowadzić do pH 7,4 za pomocą NaOH i utrzymywać na lodzie.
nuta: Użyj 50 ml buforu wychwytowego i dodaj ligand. Pargyline jest dodawany, aby zapobiec degradacji DA przez utlenianie przez monoaminooksydazę (MAO). Inhibitor COMT (RO-41-0960) jest dodawany w celu zapobieżenia degradacji DA (ogólnie katecholamin) przez COMT. Dezypramina jest dodawana w celu zahamowania wychwytu przez transportery noradrenaliny i serotoniny, a tym samym sprawia, że wyniki wychwytu są specyficzne dla transportera dopaminy (DAT).
- Przygotować bufor wychwytowy + ligand + kokainę (coc) łącząc następujące elementy: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mMMgSO4, 1 mM kwas askorbinowy (0,194 g/L), 5 mM D-glukoza (0,991 g/L), 1 μM pargynina, 100 nM dezypramina, 10 nM inhibitor COMT, 500 μM kokaina. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH i trzymaj na lodzie.
nuta: Użyj 7 ml buforu wychwytowego + ligand i dodaj kokainę. Kokainę dodaje się w celu uzyskania pomiaru tła nieswoistego wychwytu DA w celu odjęcia od danych, pozostawiając tylko wychwyt specyficzny dla DAT (ponieważ SERT i NET są hamowane przez dezypraminę, jak opisano powyżej). Alternatywnie można zamiast tego zastosować bardzo silny i specyficzny inhibitor DAT GBR-12935.
Ważne: Od teraz trzymaj wszystko na lodzie.
- Preparat synaptosomalny
- Poświęć jedną mysz na raz przez zwichnięcie szyjki macicy i ścięcie.
- Przeciąć skórę nożyczkami, aby odsłonić czaszkę i odciąć nadmiar tkanki z tyłu czaszki pozostałej po ścięciu. Przetnij czaszkę małymi prostymi nożyczkami wzdłuż szwu strzałkowego, kończąc jak najbardziej do przodu.
- Umieść dwie końcówki nożyczek w każdym oku myszy i przetnij czaszkę, aby usunąć pozostałą część czaszki i nienaruszony mózg. Szybko usuń mózg i umieść go w lodowatym PBS. To sprawi, że będzie zimny, podczas gdy drugi mózg zostanie wypreparowany.
- Za pomocą macierzy mózgowej wypreparuj 3 mm koronalny wycinek prążkowia (przednio-tylny: +1,5 mm do -1,5 mm), a następnie dokładniejsze rozwarstwienie za pomocą dziurkacza. Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z obszarem stempla.
- Utrzymuj tkankę na lodzie przez cały czas, poruszając się do przodu.
- Przenieś tkankę do mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu zważenia.
nuta: Ciężar ten zostanie użyty w kroku 1.2.14.
- Powtórz kroki 1.2.1-1.2.6 dla drugiego mózgu.
- Po uzyskaniu masy ciała dla obu mózgów przenieś tkankę do szklanki homogenizacyjnej zawierającej 1 ml lodowatego buforu homogenizacyjnego.
- Homogenizuj tkankę za pomocą tłuczka napędzanego silnikiem z prędkością 800 obr./min, 10 równych uderzeń.
nuta: Jedno pociągnięcie równa się jednemu ruchowi w górę iw dół. Pierwszy skok powinien trwać około 5 s, kolejne 3-4 s. Homogenizacja w pożywce izotonicznej jest ważna, aby zapobiec pękaniu synaptosomów. Użycie odpowiedniej siły i pożywki izotonicznej pozwoli zakończeniom presynaptycznym na ponowne uszczelnienie otaczającej cytoplazmy, pęcherzyków synaptycznych, mitochondriów i cytoszkieletu.
- Przenieść homogenat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zebrać pozostały homogenat ze szkła homogenizacyjnego, przepłukując je dodatkowym buforem homogenizacyjnym o pojemności 0,5 ml.
- Trzymaj próbkę na lodzie, podczas gdy tkanka z drugiego mózgu jest homogenizowana. Uruchom dwa mózgi równolegle w krokach 1.2.12-1.2.13.
- Osadzać jądra i resztki komórek przez odwirowanie (1 000 x g, 10 min, 4°C).
- Przenieść supernatant (S1) (zawierający błony komórkowe i cytoplazmę) do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wirować przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C.
- Odrzucić supernatant (zawierający cytoplazmę) i ponownie zawiesić osad (P2) (zawierający surowe synaptosomy) w 40 μl buforu homogenizacyjnego / mg tkanki (w oparciu o masę uzyskaną w kroku 1.2.6). Delikatnie ponownie zawiesić surową frakcję synaptosomalną za pomocą pipety p1000, ponieważ zbyt duża siła spowoduje uszkodzenie synaptosomów.
nuta: Ważne jest, aby uzyskać co najmniej 280 μl. Jeśli nie, konieczne będzie rozcieńczenie w ilości większej niż 40 μl na mg. Kroki 1.2.1-1.2.13 muszą być wykonane tak szybko, jak to możliwe, a wszystko musi być trzymane na lodzie. Gdy tylko surowe synaptosomy zostaną ponownie zawieszone w buforze homogenizacyjnym, są dość stabilne, o ile są utrzymywane na lodzie.
2. Eksperyment absorpcyjny
- Dodać 440 μl buforu absorpcyjnego + ligand + kokainę do wyznaczonych 12 probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i 440 μl buforu absorpcyjnego + liganda do 36 pozostałych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (patrz tabela 1 dla układu).
nuta: Usuń je z lodu 15 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, aby doprowadzić je do temperatury pokojowej, ale do tego czasu trzymaj je na lodzie, aby zachować inhibitory.
- Przygotować krzywą wysycenia (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (dopamina 3-H) (91,1 Ci/mmol) w różnych stężeniach końcowych (0,031, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 i 1,0 μM)).
- Oznacz sześć probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml jako 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 i 0,31.
- Dodaj 750 μl buforu absorpcyjnego + ligand do 5 probówek wirówek o najniższej liczbie.
- Do probówki oznaczonej numerem 10 dodać 1 455,4 μl buforu wychwytowego + ligand, 14,6 μl dopaminy (1 mM), 30 μl dopaminy 3-H (11 μM).
- Przenieść 750 μl z probówki oznaczonej numerem 10 do probówki oznaczonej numerem 5. Dobrze wymieszać i przenieść 750 μl z tej probówki do probówki 2,5. Powtórzyć to rozcieńczenie z pozostałymi probówkami.
- Filtry z mikrofibry szklanej należy wstępnie wypłukać buforem absorpcyjnym o pojemności 4 ml po umieszczeniu ich w 12-dołkowym wiadrze z filtrem.
- Dodać 10 μl zawiesiny błony synaptosomalnej do pierwszych 24 probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (patrz tabela 1 dla układu) zawierających 440 μl buforu. Ostrożnie wiruj i krótko wiruj, aby upewnić się, że synaposomy są zanurzone w buforze. Pozostawić w temperaturze 37 oC na 10 min.
nuta: Ważne jest, aby być dokładnym co do czasu podczas eksperymentu wychwytu, aby uzyskać uczciwe porównanie między mózgami. Użyj stopera, aby uzyskać precyzję.
- Dodać 50 μl dopaminy o stężeniach 10 i 5 μM (sekcja 2.2) do pierwszych dwóch kolumn i pozostawić w temperaturze 37 °C na 5 minut wstrząsając. Dokładnie po 5 minutach zatrzymaj reakcję, dodając 1 ml lodowatego buforu wychwytującego. To samo należy zrobić ze stężeniami 2,5 i 1,25 μM (sekcja 2.2), a następnie ze stężeniami 0,62 i 0,31 μM.
- Dodaj próbki do wstępnie wypłukanych filtrów z mikrofibry i przemyj je lodowatym buforem absorpcyjnym o pojemności 5 x 4 ml. Po dodaniu pierwszych 12 próbek do filtrów, przenieś filtry do rurek scyntylacyjnych. Powtórz to z następnymi 12 próbkami.
- Powtórz kroki 2.4-2.6 dla następnego mózgu.
- Przygotuj 3 probówki do maksymalnego liczenia, umieszczając filtr z mikrofibry na dnie probówek scyntylacyjnych 49-51 i dodając 25 μl maksymalnego stężenia dopaminy na wierzch (10 μM).
- Pozostaw wszystkie 51 rurek scyntylacyjnych w dygestoriach na 1 godzinę.
- Dodać 3 ml płynu scyntylacyjnego do każdej probówki scyntylacyjnej i energicznie wstrząsać na shakerze przez 1 godzinę.
- Policz [3H]-DA w liczniku beta przez 1 minutę.
- Otwórz program i wybierz: Etykieta: H-3, Płytka/Filtr: Fiolka 4 mL, 4 na 6, Typ testu: Normalny i Czas liczenia: 1 min.
nuta: Ten krok można wykonać następnego dnia, jeśli jest to wygodniejsze. Pozostaw próbki przykryte folią aluminiową na noc.
- Oznaczanie białek
- Użyj standardowego zestawu do oznaczania białek BCA, aby określić stężenia białek w synaptosomach w celu dostosowania liczby na minutę (cpm) do fmol/min/μg oraz w celu prawidłowego porównania wychwytu między próbkami.
3. Analiza danych
- Wykorzystaj dane z eksperymentu wychwytu, aby utworzyć krzywą nasycenia dla każdej grupy i obliczyć szybkość reakcji (Vmax) oraz stałą Michaelisa Mentena (KM).
nuta: Wartość KM odzwierciedla stężenie substratu wymagane do osiągnięcia połowy Vmax. W związku z tym Vmax bezpośrednio odzwierciedla funkcję DAT (maksymalna zdolność absorpcji), która zależy od liczby DAT na powierzchni i od tego, jak jego aktywność może być modulowana przez modyfikacje potranslacyjne i/lub białka oddziałujące, a także od zmian w gradientach jonów. Wartość KM jest pośrednią miarą powinowactwa substratu do transportera, które, co ważne, może być również modulowane przez modyfikacje potranslacyjne i/lub białka oddziałujące. Aby w pełni ocenić zmiany funkcjonalne, ważne jest zatem bezpośrednie określenie poziomów ekspresji powierzchniowej, na przykład za pomocą testu biotynylacji powierzchniowej.
Tabela 1: Układ probówek mikrowirówek do przygotowania synaptosomalnego.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
| 10 | 5 | Rozdział 2.5 | Wydanie orzeczenia 1,25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | Rozdział 2.5 | Wydanie orzeczenia 1,25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | Rozdział 2.5 | Wydanie orzeczenia 1,25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 + COC | 5 + COC | 2,5 + COC | 1,25+coc | 0,62+COC | 0,31+COC |
