Znakowanie interneuronów wypełnionych biocytyną w wycinkach hipokampa szczurów w celu wizualizacji

Streszczenie

Źródło: Economides, G., et al. Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje procedurę barwienia utrwalonych wycinków mózgu szczura zawierających interneurony wypełnione biocytyną. Protokół obejmuje inkubację z kompleksem awidyny-biotyny (ABC), barwienie za pomocą HRP i substratu chromogennego, konserwację struktur tetratlenkiem osmu i zatopienie tkanki w żywicy w celu obrazowania.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt

.

1. Oznaczanie białka wiążącego wapń lub zawartości białka w interneuronach oraz wizualizacja biocytyny na podstawie zapisów elektrofizjologicznych i wypełnienia biocytyną

Uwaga: Na końcu zapisów elektrofizjologicznych, wycinki zawierające komórki wypełnione biocytyną są utrwalane przez noc przed procedurami histologicznymi. Roztwór utrwalający zostanie zastąpiony jednorazową zmianą 0,1 M buforu fosforanowego następnego ranka, jeśli reszta procedury zostanie przeprowadzona w innym dniu, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek. Aby uzyskać najlepsze wyniki, roztwór utrwalający (4% paraformaldehydu, 0,2% nasycony roztwór kwasu pikrynowego, 0,025% roztwór aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym (PB)) musi być przygotowany w dniu zapisów.

1. Pod koniec zapisu elektrofizjologicznego ostrożnie podnieś pędzlem plasterek zawierający nagraną komórkę (komórki) i umieść go w doniczce zawierającej sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF).
   nuta: Szczegóły protokołu stosowanego do przygotowania plastrów i zapisów wewnątrzkomórkowych przy użyciu ostrych elektrod zostały opisane wcześniej.
2. W dygestorium ostrożnie podnieś plasterek mózgu pędzlem i zwiń go na mały kawałek bibuły filtracyjnej wysokiej jakości. Umieść kolejny kawałek zwilżonej bibuły filtracyjnej na plasterku i umieść dwa kawałki mokrej bibuły filtracyjnej w małym plastikowym garnku zawierającym 5-10 ml roztworu utrwalającego i przechowuj w lodówce przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Przygotuj roztwór żelatyny w wodzie destylowanej. Umieść 20 ml wody destylowanej w zlewce na płycie grzejnej i podgrzej ją do 60 °C. Stopniowo dodawaj 2,4 g żelatyny do wody, poczekaj, aż się rozpuści i pozwól jej ostygnąć do 35–40 °C przed użyciem, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek.
4. Zastąp roztwór utrwalający 2 ml 0,1 M PB. Umieść plasterek na szalce Petriego i odetnij nadmiar tkanki ostrzem skalpela. Przyciętą tkankę umieścić na szalce Petriego (średnica 9 cm, wysokość 1,4 cm), upewniając się, że leży płasko bez fałd i zagnieceń, a nadmiar buforu usunąć suchym pędzlem.
5. Przykryj tkankę ciepłym roztworem żelatyny i umieść szalkę Petriego na zamrożonym bloku, aby szybko schłodzić roztwór.
6. Używając lampy kątowej, aby zapewnić kontrast, spójrz przez bok naczynia i trzymaj plasterek płasko, lekko naciskając cienkim pędzlem, aż żelatyna zacznie twardnieć.
   nuta: Żelatynę można ponownie stopić, jeśli tkanka nie leży płasko. Wszelkie niedoskonałości na powierzchni żelatyny powstałe w wyniku usuwania pędzla w miarę jej krzepnięcia można usunąć poprzez delikatne stopienie warstwy wierzchniej, przesuwając bańkę lampy blisko powierzchni na kilka sekund.
7. Naczynie z żelatyną do wiązania przenieść do lodówki i odstawić w temperaturze 4°C na 30-60 min.
8. W dygestorium wyciąć mały blok (~ 1 x 1 cm) zawierający zatopioną żelatynę tkankę naczynia za pomocą ostrza skalpela, podnieść blok za pomocą małej szpatułki i ostrożnie umieścić go w tym samym, ale świeżym roztworze utrwalającym, który służy do utrwalania plastrów, przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C.
9. Umyj blok żelatyny w 5 ml 0,1 M PB trzy razy, osusz go za pomocą kawałka chusteczki papierowej i przyklej blok stroną do góry (tj. z chusteczką u góry) na wibratomie za pomocą super kleju.
10. Usuń nadmiar kleju kawałkiem bibuły filtracyjnej i za pomocą ostrza skalpela odetnij rogi bloku, pozostawiając kształt rombu.
11. Plasterek o grubości 50 μm należy podzielić na części za pomocą wibratomu i ostrożnie umieścić każdy fragment w szklanej fiolce zawierającej 10% sacharozy.
12. Ostrożnie pobrać fragment z fiolki i umieścić go płasko w pokrywce szalki Petriego. Używając mikroskopu preparacyjnego i świeżego ostrza skalpela, usuń żelatynę z okolic skrawka i umieść wycinek z powrotem w fiolce zawierającej 2 ml świeżej 10% sacharozy
    nuta: Na tym etapie bardzo ważne jest usunięcie jak największej ilości żelatyny, aby zmniejszyć kurczenie się tkanek na etapie odwodnienia (krok 1.37).
13. Kriozabezpiecz skrawki w 0,1 M roztworze sacharozy i glicerolu na bazie PB w temperaturze pokojowej, inkubując je przez 10 minut w 10% roztworze sacharozy, 20 minut w 20% roztworze sacharozy i 6% glicerolu dwukrotnie, a na koniec 30 minut w 30% roztworze sacharozy-12% glicerolu dwa razy pod ciągłym mieszaniem.
14. Ułóż sekcje płasko na małym prostokącie z folii aluminiowej za pomocą pędzla. Usuń nadmiar płynu z sekcji i ostrożnie złóż folię aluminiową do paczki.
15. Trzymaj paczkę blisko powierzchni ciekłego azotu, nie dotykając powierzchni przez 30 s, a następnie pozwól sekcjom całkowicie się rozmrozić przez około 30 sekund. Powtórz zamrażanie-rozmrażanie jeszcze dwa razy.
16. Usunąć wszystkie skrawki pędzlem i umieścić je w szklanej fiolce zawierającej 2 ml 0,1 M PB pod ciągłym mieszaniem w celu zmycia nadmiaru sacharozy.
17. Usunąć PB pipetą Pasteura i inkubować skrawki w 2 ml 1% wodnego nadtlenku wodoru (_H2O2) przez 30 min. Przemyć skrawki w 2 ml 0,1 M PB 3x 5 min.
18. Usunąć 0,1 M PB za pomocą pipety Pasteura i dodać 1 % borowodorku sodu (NaBH₄) do 0,1 M PB.
    nuta: Nie należy zamykać fiolki, ponieważ roztwór NaBH₄ wydziela wodór.
19. Usunąć borowodorek sodu pipetą Pasteura i dokładnie umyć skrawki w 2 ml 0,1 M PB 5x 5 min.
20. Zastąp 0,1 M PB 10% normalną surowicą kozią (NGS) w 0,1 M PB na 30 min.
21. Usunąć surowicę kozią i inkubować skrawki przez noc w temperaturze 4 °C w mieszaninie mysich przeciwciał monoklonalnych i króliczych przeciwciał poliklonalnych sporządzonych w roztworze ABC.
    nuta: Wykaz pierwszorzędowych przeciwciał stosowanych w poprzednich badaniach przedstawiono w Tabeli 1.
22. Inkubować skrawki przez 2 godziny w ciemności w mieszaninie znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych (tabela materiałów).
23. Zamontuj sekcje na prowadnicach w podłożu montażowym i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym.
24. Zrób zdjęcia znakowania fluorescencyjnego przy 40-krotnym powiększeniu (ryc. 1Bb).
25. Po wykonaniu obrazowania fluorescencyjnego umieścić szkiełko podstawowe w szklanej szalce Petriego zawierającej PBS i ostrożnie usunąć szkiełko nakrywkowe. Następnie zmyj skrawki szkiełka delikatnymi impulsami PBS z pipety Pasteura. Umieścić skrawki w czystej szklanej fiolce zawierającej PBS.
26. Przeprowadzić reakcję awidyna-HRP, najpierw inkubując skrawki w ABC przez co najmniej 2 godziny w celu amplifikacji produktu reakcji HRP.
27. Przygotować roztwór 3,5-diaminobenzydyny (DAB), dodając jedną tabletkę do 5 ml wody destylowanej.
28. Przemyć sekcje PBS trzy razy przez 10 minut, a następnie dwukrotnie buforem Tris przez 10 minut. Po ostatnim myciu usunąć bufor Tris.
29. Szybko dodać jedną kroplę 8% roztworu NiCl₂ (chlorek niklu) do roztworu DAB, odpipetować roztwór do wymieszania i szybko dodać 1 ml tego roztworu na poszczególne sekcje. Inkubować skrawki w roztworze DAB/NiCl₂ przez 15 minut.
30. Dodać 10 μl 1% H₂O₂ do roztworu DAB. Pozwól, aby reakcja przebiegała w ciemności pod ciągłym mieszaniem przez około 1 do 2 minut i monitoruj znakowanie wypełnionych komórek za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
31. Zatrzymać reakcję, usuwając roztwór DAB/NiCl₂/H₂O₂ i przemyć sekcje buforem Tris dwukrotnie przez 5 minut.
32. W dygestorium umieścić mały okrąg bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i zwilżyć go 0,1 M PB. Podnieś skrawki pojedynczo ze szklanej fiolki za pomocą pędzla i ostrożnie umieść je płasko na papierze.
33. Przykryj skrawki kolejnym zwilżonym okręgiem bibuły filtracyjnej i usuń nadmiar buforu, delikatnie dotykając bibułą o powierzchnię.
34. Nanieś 8–9 kropli 1% tetratlenku osmu w 0,1 M PB na górny papier, przykryj naczynie i pozostaw w dygestoriach przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż 1 godzinę.
35. Otwórz szalkę Petriego i podnieś górną bibułę filtracyjną. Ostrożnie podnieś sekcje pojedynczo za pomocą pędzla, umieść je w szklanej fiolce i dwukrotnie opłucz w wodzie destylowanej.
36. Odpady tetratlenku osmu należy utylizować w odpowiedni sposób. Wypłucz cały jednorazowy sprzęt i umieść go w odpowiednich pojemnikach.
37. Umieść każdą sekcję płasko na szkiełku podstawowym i nakryj sekcje. Przenieść szkiełko na szalkę Petriego, umieścić pustą szklaną fiolkę na szkiełku nakrywkowym, aby utrzymać je na miejscu, i zalać 50% alkoholem. Po 15 minutach wyjąć szkiełko z roztworu i usunąć fragmenty z szkiełka. Umieść sekcje z powrotem na szkiełku, a następnie umieść szkiełko w 70% alkoholu na 15 minut. Powtórz ten sam proces z 95% i na końcu 100% roztworem alkoholu.
38. Po etapie odwadniania przenieść skrawki do szklanej fiolki zawierającej 100% alkoholu na shakerze w dygestorium. Zastąp roztwór alkoholu tlenkiem propylenu (C_{, 3},_H6O) i myj trzykrotnie przez 5 minut. Po ostatnim przemyciu trzymaj ~2 ml tlenku propylenu w fiolce i dodaj żywicę (w stosunku 1:1). Upewnij się, że żywica jest rozpuszczona i utrzymuj sekcje w ciągłym mieszaniu przez 30 minut.
39. Umieść każdą sekcję w aluminiowej planszecie zawierającej żywicę epoksydową za pomocą drewnianego patyczka i inkubuj przez noc.
    UWAGA: Nie pozostawiaj sekcji w żywicy dłużej niż 24 godziny, aby uniknąć ryzyka uszkodzenia sekcji.
40. Umieść planszetkę na płycie grzejnej na około 10 minut. Podnieś każdą sekcję drewnianym patyczkiem i umieść ją na czystym szkiełku. Utrzymuj spójną orientację każdej sekcji za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Umieść szkiełko nakrywkowe na sekcjach. Umieścić szkiełko w piekarniku na 48 godzin w temperaturze 56 °C w celu utwardzenia.

Tabela 1: Tabela rozwiązań.

Zastosowane rozwiązania	Skład/Instrukcje
Rozwiązanie do utrwalania	4% paraformaldehyd, 0,2% nasycony roztwór kwasu pikrynowego, 0,025% roztwór aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym (PB)
Bufor fosforanowy 0,1 M pH 7,6	Dodaj 100 ml bulionu 1 M buforu fosforanowego do 900 ml wody destylowanej
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4/7,5	Dodaj 10 ml 0,1 M buforu fosforanowego, 0,2 g KCl i 8,76 g NaCl do 990 ml wody destylowanej
Bufor TRIS pH 7,5	Rozpuścić 5,72 g chlorowodorku Tris i 1,66 g zasady Tris w 50 ml wody destylowanej. Następnie uzupełnić do 1 l wodą destylowaną.
Buforowany roztwór utrwalający aldehyd glutarowy i paraformaldehyd	4% paraformaldehydu, 0,2% nasycony roztwór kwasu pikrynowego, 0,025% roztwór aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym.
Rozwiązanie ABC	Roztwór należy przygotować co najmniej 30 minut przed użyciem z zestawu ABC. Dodać 1 kroplę roztworu A i 1 kroplę roztworu B do 2,5 ml PBS.
Żywica epoksydowa Durcupan:	Na przygotowanie 20 doniczek: 20 g składnika A, 20 g składnika B, 0,6 g składnika C i 0,4 g składnika D-
	Chroń wagę przed rozlaniem, przykrywając płytkę kółkiem z bibuły filtracyjnej. Ostrożnie odważyć odczynniki do zlewki tripour w proporcjach podanych powyżej. Dokładnie wymieszaj, energicznie mieszając dwoma drewnianymi patyczkami przez co najmniej 5 minut. Mieszanina powinna uzyskać jednolitą gęstość, ciemnobrązowy kolor. Umieść zlewkę w piekarniku w temperaturze ~50 °C na maksymalnie 10 minut, aby usunąć jak najwięcej pęcherzyków powietrza. nuta: Żywica zacznie twardnieć, jeśli pozostawisz zlewkę w piekarniku dłużej niż 10 minut. Przelej żywicę do plastikowych garnków lub strzykawek o pojemności 5 ml, datuj je i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20 °C w stanie gotowym do użycia.

Wyniki

Rysunek 1: Rekonstrukcje neuronalne dwóch typów komórek koszyczkowych zarejestrowanych i wypełnionych w regionie CA2 hipokampa i skorelowane dane elektrofizjologiczne uzyskane po zapisach wewnątrzkomórkowych in vitro. Liczba ta została zmodyfikowana w stosunku do poprzednich badań. SO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Molecula...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało przeciwko kwasowi awidyno-7-amino-4-metylokoumaryno-3-octowemu (Avidin-AMCA) - 20,8 mg/ml	Laboratoria wektorowe	A2008
Biocytyna ≥98% (TLC)	Sigma	B4261
3,5 diaminobenzydyna (DAB) tabletka, Aby przygotować 5 mL	Sigma	D4293
Żywica epoksydowa Durcupan A	Sigma	44611
Żywica epoksydowa Durcupan B	Sigma	44612
Żywica epoksydowa Durcupan C	Sigma	44613
Żywica epoksydowa Durcupan D	Sigma	44614
Etanol, puriss. p.a., bezwzględny, ≥99.8%	Sigma	32221
Żelatyna	Sigma	48723
Roztwór aldehydu glutarowego, stopień I, 25 % w H2O	Sigma	G5882
Glicerol, ≥99%	Sigma	G5516
Kozia surowica	Sigma	G9023
Kozioł anty-mysi izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)- 14,3 mg/ml	Sigma	F2653
Koza anty-królik Texas Red (TR)- 3,3 mg / ml	Invitrogen	T2767
Nadtlenek wodoru, 30% roztwór	Sigma	H-1009
Olejek immersyjny, lepkość 1.250 cSt (lit.)	Sigma	I0890
Chlorek niklu	Sigma	N5756
Tetroksynek osmu, do mikroskopii elektronowej, 4% w wodzie	Sigma	75632
Paraformaldehyd, klasa odczynnika, krystaliczny	Sigma	P6148
Kwas pikrynowy, zwilżony wodą, ≥98%	Sigma	197378
Bufor fosforanowy 1 M	Sigma	P3619
Tlenek propylenu, 99%	Alfa Aesar	30765
Tetrahydroboran sodu	VWR	27885.134
Sacharoza	Fisher naukowy	S/8600/53
Chlorowodorek Trizma, ≥99.0%	Sigma	T5941
Baza Trizma, ≥99.9%	Sigma	T6066
Medium montażowe Vectashield Antifade, , współczynnik załamania światła 1,45	Laboratoria wektorowe	H-1000
Zestaw Vectastain Elite ABC HRP	Laboratoria wektorowe	PK6100
Używany sprzęt
Wibratom	Agar Naukowy
C4A Aluminiowe deski z miseczką	GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Mikroskop Leica DMR	Leica Microsystems
Fluorescencyjne źródło światła X-Cite 120PC Q	Excelitas Technologies
Cyfrowa kamera mikroskopowa Leica DFC450	Leica Microsystems
Pióro do rysowania technicznego Rapidograph 0,18mm	Londyńskie centrum graficzne
Końcówka rapidografu 0,18 mm	Londyńskie centrum graficzne
Rapidograph rysik techniczny 0,25mm	Londyńskie centrum graficzne
Końcówka rapidografu 0,25 mm	Londyńskie centrum graficzne
System Neurolucida z komputerem PC, sceną, kamerą i joystic do sterowania sceną XYZ	Microbrighfield (MBF) Nauki biologiczne
Oprogramowanie Neurolucida w wersji 2017	Microbrighfield (MBF) Nauki biologiczne
Pakiet graficzny CorelDRAW X5	Corel
Oprogramowanie do edycji wideo	Adobe Premiere Pro
Fiolki szklane 14 ml	Fisher naukowy