Ocena upośledzenia motorycznego w modelach C. elegans za pomocą testu lokomocji radialnej

Streszczenie

Źródło: Currey, H. N., i wsp. Ocena upośledzenia motorycznego w C. elegans Modele stwardnienia zanikowego bocznego. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje zastosowanie testu lokomocji promieniowej do oceny dysfunkcji motorycznej u C. elegans wykazujących ekspresję ludzkiego białka TDP-43 typu dzikiego lub z mutacją ALS. Robaki o różnym poziomie ekspresji TDP-43 typu dzikiego lub zmutowanego mogą pełzać, a ich ruch jest mierzony odległością promieniową przebytą od centralnego punktu na płytce testowej. Test rozróżnia łagodne, umiarkowane i ciężkie upośledzenie motoryczne na podstawie odległości przebytej przez różne szczepy C. elegans.

Protokół

1. Test lokomocji promieniowej

1. Przygotować szalki Petriego o średnicy 100 mm lub 150 mm, wypełnione mniej więcej w połowie pożywką dla nicieni (NGM) i obsiane jednolitym trawnikiem bakterii OP50, aby pokryły całą powierzchnię agaru.
2. Odwróć płytki testowe NGM do góry nogami i oznacz spód identyfikatorem szczepów C. elegans do oznaczenia, po 2 płytki na szczep (ryc. 1A).
3. Zrób małą kropkę ze znacznikiem na środku odwróconej płytki (Rysunek 1A).
4. Podczas pracy z mikroskopem preparacyjnym przenieś 15-20 dopasowanych do siebie ślimaków do środka płytki testowej bezpośrednio nad środkową kropką (widoczną przez NGM) za pomocą kilofa z drutu platynowego (Rysunek 1B).
   nuta: Spróbuj przenieść wszystkie robaki w tym samym czasie lub tak szybko, jak to możliwe.
   1. Ustaw minutnik na 30 minut po umieszczeniu robaków na środku płytki. Odłóż pokrywkę z powrotem na talerz i odłóż ją na bok (Rysunek 1C).
5. Kontynuuj przenoszenie robaków, aż wszystkie szczepy znajdą się na wyznaczonych płytkach testowych, notując w przybliżeniu, ile czasu zajmuje przeniesienie między płytkami (staraj się przez ~ 1 minutę między płytkami). Zachowaj wszystkie tablice w tej samej kolejności, w jakiej zostały ustawione.
6. Po 30 minutach zacznij nacinać pierwszą płytkę.
   1. Zdejmij pokrywkę i umieść płytkę stroną zadrukowaną do dołu pod mikroskopem preparacyjnym, tak aby oznaczony tył płytki był skierowany do góry, a agar NGM znajdował się między linią wzroku a robakami. Talerz będzie odwrócony do góry nogami podczas normalnego użytkowania.
   2. Dostosuj ostrość mikroskopu, aż robaki będą widoczne przez agar.
   3. Używając pisaka w innym kolorze od środkowego punktu, umieść małą kropkę w miejscu każdego robaka - podążaj za śladami robaków przez trawnik bakteryjny, aby znaleźć najbardziej dystalne zwierzęta.
   4. Sprawdź krawędź płytki, ponieważ niektóre robaki mogą się tam znaleźć. Policz również i zapisz liczbę robaków w środkowej kropce punktu (Rysunek 1D).
7. Kontynuuj oznaczanie wszystkich płytek testowych w kolejności, tak aby wszystkie płytki miały 30 minut czasu aktywności, uważając, aby uwzględnić czas potrzebny na ustawienie płytki. Następnie wykonaj pomiary ręczne lub cyfrowe zgodnie z opisem w krokach 1.8 lub 1.9.
8. Wykonuj pomiary ręczne za pomocą linijki.
   1. Użyj linijki, aby zmierzyć w mm odległość od punktu środkowego do końcowych oznaczeń lokalizacji dla każdego robaka i zapisz odległość. Aby ułatwić śledzenie postępów podczas oceniania, oznacz pierwszy zdobyty punkt małą linią.
   2. Zapisz dane dotyczące długości dla każdej kropki po kolei, obracając płytkę w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara (Rysunek 1E).
9. Wykonaj pomiar cyfrowy za pomocą skanera i ImageJ.
   1. Za pomocą skanera płaskiego zeskanuj tylną część płytki testowej (płytek) testowej obok linijki (cyfry skierowane w stronę powierzchni skanowania) (Rysunek 2A).
   2. Otwórz zeskanowany obraz płyty w ImageJ lub podobnym programie.
      nuta: ImageJ to bezpłatne oprogramowanie do przetwarzania obrazów oparte na Javie hostowane przez NIH.
   3. Kliknij narzędzie Linia prosta, a następnie narysuj linię łączącą punkty 1 cm i 2 cm na zeskanowanym obrazie linijki (Rysunek 2B).
      nuta: Przytrzymanie klawisza Shift w komputerze wymusi ustawienie linii pod kątem 45°.
   4. Przejdź do menu Analizuj i użyj go, aby ustawić skalę (Analizuj | Ustaw skalę) (Rysunek 2C).
   5. Wprowadź znaną odległość (10) i jednostki długości (mm) w odpowiednich polach, nie dostosowuj odległości w liczbie pikseli. Zaznacz opcję Globalne, aby zastosować tę samą skalę do wszystkich obrazów analizowanych w każdej sesji ImageJ; w przeciwnym razie ustaw skalę dla każdego obrazu po otwarciu (Rysunek 2D). Kliknij przycisk Ok.
      nuta: Kroki 1.9.2-1.9.5 są wykonywane w celu ustawienia skali pomiaru. Pomiary dla tego obrazu będą teraz automatycznie wiązać długość linii ze zdefiniowaną relacją piksel: długość. Obrazy zeskanowane w rozdzielczości 300 dpi będą miały przybliżoną zależność 11,8 piksela na mm.
   6. Użyj narzędzia Pędzel, aby zaznaczyć tuż nad pierwszym punktem, który ma zostać zdobyty.
      nuta: Jest to wizualny wskaźnik pierwszego wykrytego robaka.
   7. Użyj narzędzia Linia prosta, aby narysować linię od punktu środkowego do pierwszego punktu danych robaka.
   8. Kliknij klawisz M na klawiaturze, aby zmierzyć odległość. Możesz też przejść do menu Analizuj i wybrać polecenie Zmierz (Analizuj | Środek). W obu przypadkach pomiar pojawi się w nowym oknie; W tym oknie zostaną zebrane wszystkie pomiary dla każdego obrazu.
   9. Utrzymując punkt środkowy na stałym poziomie, przesuń koniec linii dotykającej pierwszego punktu ślimaka do następnego punktu ślimaka, przesuwając się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie kliknij klawisz M, aby zmierzyć.
   10. Kontynuuj mierzenie każdego punktu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż wszystkie punkty zostaną zdobyte.
   11. Skopiuj i wklej dane pomiaru długości do arkusza kalkulacyjnego, aby je zapisać. Następnie powtórz ten proces dla każdego zeskanowanego obrazu płyty.
       nuta: Kroki 1.9.6 - 1.9.11 mierzą wartości przemieszczenia ślimaka (Rysunek 2E-F).
10. Przeprowadzanie analiz statystycznych.
    1. Połącz powtórzenia w jednym eksperymencie, tak aby łączna liczba zdobytych robaków wynosiła od 30 do 40
    .
    2. Wykonuj niezależne repliki eksperymentalne w różnych dniach i z niezależnymi populacjami robaków, aby uzyskać 3 niezależne powtórzenia eksperymentalne.
    3. Analizuj dane za pomocą odpowiednich analiz statystycznych, takich jak test t Studenta dla 2 szczepów lub 1-czynnikowa ANOVA dla trzech lub więcej szczepów.

Wyniki

Rysunek 1: Przebieg badania lokomocji promieniowej. Panele A-E pokazują uogólnione etapy testu lokomocji promieniowej. Kroki są następujące: (A) Płytki NGM, z OP50 wysianymi na krawędziach, są przygotowywane przez etykietowanie i oznaczanie centralnej kropki, (B) robaki umieszcza się w środku agaru zgodnie z centralną kropką, (C) ro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C. elegans	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)	-	Zaopatrz się w swoje szczepy według potrzeb, N2 jest użytecznym szczepem kontrolnym
Jednorazowe pipety Pasteura, szkło borokrzemianowe	VWR	14673-010	Szklana pipeta używana do tworzenia wytrychów ślimakowych - trzymaj szklaną pipetę w jednej ręce, a ~ 1 "drutu platynowego (trzymanego przez szczypce) w drugiej nad płomieniem, aby połączyć.
Szalki Petriego jednorazowe, 35x10mm	VWR	10799-192	Płytki probiercze do systemu obrazowania WormLab
Szalki Petriego jednorazowe, 60x15mm	VWR	25384-090	Tabliczki magazynowe do robaków
Jednorazowe szalki Petriego, 100x15mm	VWR	25384-302	Standardowa płytka do badania lokomocji promieniowej
Szalki Petriego jednorazowe, 150x15mm	VWR	25384-326	Płytka do badania lokomocji promieniowej o dłuższym przedziale czasowym
Mikroskop preparacyjny	Leica	M80	Zakres do utrzymywania robaków i ustawiania testów lokomocji radialnej
Markery z cienką końcówką	VWR	52877-810	Potrzebujesz co najmniej 2 kolorów do testów lokomocji promieniowej. Do dokładności wymagane są drobne końcówki.
Skaner płaski	Amazonka	Epson Perfection V850	Opcjonalnie do testu lokomocji radialnej. Protokół zakłada rozdzielczość 300dpi, większość skanerów będzie działać poprawnie
NGM (pożywka wzrostu nicieni)	VWR	76347-412	Pożywka używana do uprawy C. elegans. Może być wykonany od podstaw, zobacz WormBook: Konserwacja C. elegans
Bakterie OP50	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)	OP50	Główne źródło pożywienia dla C. elegans
p1000 pipettor	VWR	76207-552	Pipettor, używany w testach pływackich
p1000 wskazówek	VWR	83007-384	Końcówki do pipettora, używanego w teście pływackim
Drut platynowy, średnica 0,2032mm	VWR	BT136585-5M	Drobny drut platynowy używany do tworzenia kilofa ślimakowego - trzymaj szklaną pipetę w jednej ręce i ~ 1 "drutu platynowego (trzymanego przez szczypce) w drugiej nad płomieniem, aby połączyć.
Linijka	VWR	56510-001	Konieczność wykonania testów lokomocji promieniowej
ImageJ	NIH	-	Opcjonalne darmowe oprogramowanie dostarczone przez Narodowy Instytut Piłki Nożnej - https://imagej.nih.gov/ij/
System obrazowania WormLab	MBF Bioscience	WormLab	W skład systemu obrazowania wchodzą Sprzęt WormLab (jasne pole scena, kamera i obudowa) oraz oprogramowanie WormLab. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- system