Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie
- Przygotowanie i cięcie tkanek
- Szczury należy losowo podzielić na trzy grupy: świeże/solne (SAL; 0,9% NaCl), z prefiksem/SAL i z prefiksem/3,4-metylenodioksymetamfetaminą (MDMA; szczegóły w tabela 1).
- Podawać trzy dawki 1 ml/kg SAL i 10 mg/kg MDMA odpowiednio dootrzewnowo grupom SAL i MDMA w odstępie 2 godzin. Pozwól zwierzętom przetrwać leczenie przez 6 dni.
- W dniu 7 podaj 100 mg/kg ketaminy w połączeniu z 5 mg/kg ksylazyny dootrzewnowo szczurom w celu głębokiego znieczulenia (i.e., utrata mrugania rogówką i odruchy szczypania ogona).
- W przypadku grupy świeżej/SAL szybko odetnij głowy szczurom i usuń mózg do świeżego testu mózgu.
- W przypadku grup z prefiksem/SAL i z prefiksem/MDMA wykonaj nacięcie wzdłuż mostka około 10 -12 cm, a następnie odsłoń koniec mostka.
- Przytrzymaj koniec mostka hemostatem i przetnij przeponę bocznie po obu stronach ostrymi nożyczkami, a następnie przetnij w górę przez żebra i równolegle do płuc.
- Jedną ręką przytrzymaj brzuszny koniec serca małymi kleszczami. Drugą ręką przekłuć lewą komorę igłą strzykawkową 18 G (należy zauważyć, że strona adaptera igły jest połączona silikonowym wężem w kształcie litery Y z lodowatymi pojemnikami SAL i paraformaldehydowymi oraz pompami perystaltycznymi).
- Włączyć pompę SAL na średnim poziomie natężenia przepływu (~5 ml/min) i przekłuć prawy przedsionek kleszkami, aby umożliwić ucieczkę z krążenia powrotnego. Utrzymuj perfuzję SAL przez 30 minut.
- Włącz pompę paraformaldehydu na średnim poziomie i pozwól lodowate 4% paraformaldehydowi przenikać zwierzę przez 30 minut.
- Wyjmij narzędzie do perfuzji i odetnij głowę zwierzęciu. Wykonaj tylne przednie przecięcie przez linię środkową czaszki, a następnie trzepocz czaszką, aby odsłonić jamę czaszki.
- Wyjąć mózg szpatułką z jamy czaszki i umieścić mózg w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml 4% paraformaldehydu. Trzymaj mózg w probówce zawierającej paraformaldehyd w lodówce o temperaturze 4 ºC przez 24 godziny.
- Przenieść mózg do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml 30% roztworu sacharozy w temperaturze 4 °C przez 3 dni. Na koniec przechowuj mózg w plastikowych torebkach w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
- Zamontuj mózg na uchwycie z pożywką do zatapiania i zamroź pożywkę zawierającą mózg w kriostacie w temperaturze -26 ºC. Pokrój świeżo zamrożony mózg na sekcje 20 μm, a mózg z prefiksem paraformaldehydu na sekcje 10 μm. Przenieś przekrój do szkiełka mikroskopowego o temperaturze pokojowej (RT), dotykając szkiełka do sekcji.
- Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Szkiełka sekcyjne przechowywać w szczelnie zamkniętej torbie w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
- Odwodnienie
- Pobrać szkiełka z zamrażarki o temperaturze -80 °C i przypisać sekcje do jednego z trzech testów: gen receptora serotoniny 5-HT2A (}ht2a), ppiB (gen izomerazy peptydyloprolilu B, kontrola pozytywna) lub dapB (bakteryjny gen reduktazy dihydrodipikolinianowej, kontrola ujemna); Zaznaczaj i oznaczaj sekcje długopisem (nie używaj ołówka). Zanurz szkiełka w 100% alkoholu o temperaturze pokojowej na 5 minut. Suszyć szkiełka przez 5 minut w dygestorium.
- Wstępnej obróbki
- Odpipetować 20 μl odczynnika Pretreat-1 (inaktywacja fosfatazy alkalicznej) do skrawków na szkiełkach. Umieść szkiełka na szynie stojaka w tacce na wilgoć (należy pamiętać, że taca jest przykryta pokrywką, aby utrzymać wysoką wilgotność, aby zapobiec parowaniu z roztworu reakcyjnego).
- Delikatnie potrząsaj tacką na wilgoć na poziomej wytrząsarce na niskich obrotach przez 10 minut. Umyj szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) przez 2 minuty. Zanurzyć szkiełko w zlewce o pojemności 200 ml zawierającej 150 ml odczynnika Pretreat-2 (zerwanie wiązań krzyżowych wywołane wiązaniem paraformaldehydu). Gotuj szkiełka w sumie przez 5 minut w temperaturze 100 ºC (odbudowa struktury RNA wywołana ciepłem).
- Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą ddH2O przez 2 minuty. Umieść szkiełka w 100% alkoholu na 5 minut. Suszyć szkiełka przez 5 minut w dygestorium. Użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować okrąg wokół wybranego obszaru w sekcji tkanki (e.g., struktury niekorowe, w tym wzgórze i podwzgórze, jak opisano na Rysunek 1).
- Odpipetować 10 μl odczynnika Pretreat-3 (zwiększa penetrację sondy) do każdego wybranego obszaru i przykryć tackę na wilgoć pokrywką. Umieścić blachę w piecu do hybrydyzacji wyposażonym w wytrząsarkę poziomą i ustawić temperaturę piekarnika na 40 °C; Delikatnie potrząsaj tacką przez 30 minut. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą ddH2O przez 2 minuty.
2. Hybrydyzacja i amplifikacja
- Odpipetuj 10 μl odczynników sondy htr2a, ppiB i dapB na wybranych obszarach. Przykryj tackę na wilgoć pokrywką, aby zapobiec parowaniu odczynnika. Delikatnie potrząśnij wytrząsarką poziomą ustawioną na niską prędkość. Inkubować szkiełka w temperaturze 40 ºC w piecu przez 2 godziny.
- Szkiełka należy myć dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-1 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 ºC przez 30 minut.
- Szkiełka należy myć dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-2 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 ºC przez 15 minut.
- Szkiełka należy myć dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-3 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 ºC przez 30 minut.
- Szkiełka należy myć dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-4 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 ºC przez 15 minut.
- Szkiełka należy myć dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-5 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze RT przez 30 minut.
- Szkiełka należy myć dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-6 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty.
3. Detekcja sygnału
- Odpipetować 10 μl odczynnika Red do każdego wybranego obszaru (Należy pamiętać, że odczynnik jest mieszaniną Red-B i Red-A w stosunku 1:60 i należy go natychmiast zużyć). Umieść szkiełko w tacce na wilgoć na wytrząsarce poziomej w temperaturze pokojowej i delikatnie potrząsaj na niskich obrotach przez 10 minut.
- Umyj szkiełka dwukrotnie (ddH2O) przez 10 minut. Szkiełka suszyć w temperaturze 60 ºC w piekarniku przez 15 minut. Umieść szkiełka w ksylenie pod wyciągiem na 5 minut. Odpipetować 20 μl podłoża montażowego na bazie ksylenu na każdy wybrany obszar i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
