Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Krojenie mózgu
- Ustawić próbkę w taki sposób, aby grzbietowa strona móżdżku znajdowała się po stronie przedniej. Wlać lodowaty płyn do cięcia ACSF (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy), zawierający 1 μM TTX (tetrodotoksyna), wystarczający do całkowitego zanurzenia móżdżku. Umieść rurkę gazową w ACSF i zacznij bulgotać mieszanką gazów O2/CO2.
- Usuń pajęczynówkę za pomocą cienkiej pęsety pod lornetką. Przetnij szypułkę móżdżku ostrzem i usuń pień mózgu i blok agaru. Obróć tacę o 180°, tak aby grzbietowa powierzchnia móżdżku była skierowana w stronę żyletki.
- Ustaw ostrze i wyreguluj pierwsze miejsce cięcia. Ustaw parametry krojenia wibratomu na następujące: amplituda na 5,5, częstotliwość na 85 Hz, prędkość na 3–4 i grubość plastra na 300 μm.
- Przenieś plaster móżdżku na nylonowej siatce do akrylowego inkubatora i całkowicie zanurz plasterek w natlenionym ACSF. Inkubator należy umieścić w łaźni wodnej utrzymującej temperaturę 26 °C.
- Przechowuj plastry przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić regenerację po uszkodzeniach podczas krojenia.
2. Nagrywanie z użyciem clampu krosowego całej komórki
UWAGA: Zapis patch-clamp wymaga następującego sprzętu: mikroskopu pionowego z optyką kontrastu różnicowego w podczerwieni (IR-DIC), wzmacniacza patch-clamp, digitizera danych, stymulatora cyfrowego, izolatora, komputera, oprogramowania do akwizycji i analizy danych, manipulatora z napędem, platformy mikroskopowej, stołu do izolacji drgań, klatki Faradaya, systemu podgrzewania roztworu, pomp perystaltycznych i ściągacza elektrod.
- Dodaj pikrotoksynę (0,1 mM) do ACSF i rozpuść ją za pomocą ultradźwięków przez 3 minut.
- Przeprowadzić fuzję w komorze rejestracyjnej z ACSF zawierającym pikrotoksyny, nasyconym O2-CO2 z szybkością 2 ml / min. Utrzymuj temperaturę komory zapisu na poziomie około 30 °C.
- Wykonaj elektrodę rejestrującą, ciągnąc kapilarnę ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem (średnica zewnętrzna = 1,5 mm) za pomocą ściągacza z 4 stopniami. Średnica końcówki powinna wynosić około 1 μm.
- Wykonaj elektrodę stymulującą, pociągając tę samą kapilarnę za pomocą ściągacza w 2 krokach, a następnie przełam, aby uzyskać cienką końcówkę, uderzając końcówką o żelazny blok pod mikroskopem lornetkowym. Ostateczna średnica powinna wynosić 3–5 μm.
- Przenieś plasterek móżdżku do komory nagrywającej i przymocuj go za pomocą obciążnika Pt z nylonowymi nitkami. Napełnij elektrodę stymulującą ACSF.
- W celu stymulacji PF należy umieścić elektrodę stymulującą na powierzchni warstwy molekularnej, w odległości około 50 μm od warstwy komórek Purkinjego.
- W celu stymulacji mukowiscydozy należy umieścić elektrodę stymulującą na dnie warstwy komórek Purkinjego (kroki 3.3, 3.4).
- Filtr oparty na K+ lub Cs+ z filtrem 0,45 μm. Za pomocą mikroładowarki napełnić elektrodę rejestrującą 8 μl roztworu wewnętrznego.
- Zastosuj słabe nadciśnienie do elektrody rejestrującej przed zanurzeniem jej w ACSF. Jego rezystancja powinna wynosić 2–4 MΩ, a potencjał złączowy cieczy powinien być skorygowany.
- Zbliż się do zdrowego, jasnego korpusu ogniwa komputera za pomocą elektrody rejestrującej. Lekko popchnij powierzchnię komórki Purkinjego, przestań wywierać nadciśnienie, a następnie zastosuj podciśnienie, aż utworzy się uszczelka giga-omowa. Następnie ustal konfigurację całego ogniwa za pomocą podciśnienia.
- Utrzymuj potencjał membrany na poziomie -70 mV i zastosuj impuls -2 mV (czas trwania, 100 ms) przy 0,1 Hz, aby w sposób ciągły monitorować rezystancję wejściową, rezystancję szeregową i pojemność wejściową. Nie należy używać kompensacji rezystancji szeregowej. Odrzuć dane, gdy rezystancja szeregowa zmienia się o więcej niż 15%.
3. Indukcja LTD (długotrwała depresja)
- Stymuluj warstwę molekularną impulsem (czas trwania, 0,1 ms). Zidentyfikuj pobudzające prądy postsynaptyczne PF (Parallel fibers) (EPSC), stosując bodziec z podwójnym impulsem (interwał międzyimpulsowy (ISI) 50 ms). PF-EPSC powinien wykazywać ułatwienie parowania impulsów i stopniowy wzrost amplitudy w stosunku do wzrostu intensywności stymulacji.
- Zapisz odpowiedź testową PF-EPSC, przykładając pojedynczy impuls przy 0,1 Hz. Dostosuj intensywność bodźca tak, aby wywołana amplituda EPSC wynosiła około 200 pA. Unikaj zanieczyszczenia prądu przez kanał jonowy zależny od napięcia.
- Stymuluj mukowiscydozę na dole warstwy komórek Purkinjego i zidentyfikuj EPSC wywołany przez aktywację mukowiscydozy (poprzez zastosowanie bodźca dwuimpulsowego). CF-EPSC powinien wykazywać depresję parowanych impulsów i sposób "wszystko albo nic", w zależności od wzrostu intensywności stymulacji. W przypadku indukcji LTD należy użyć pojedynczego bodźca.
- Protokół indukujący LTD 1
- Używając elektrody zawierającej wewnętrzny roztwór na bazie K+ w warunkach cęgów prądowych, zastosuj pojedynczy bodziec PF i pojedynczy bodziec CF jednocześnie przy 1 Hz przez 5 minut (300 impulsów) (Rysunek 1A).
- Protokół indukujący LTD 2
- Używając wewnętrznego roztworu na bazie elektrody K+ w warunkach cęgów prądowych, zastosuj podwójne bodźce PF (ISI 50 ms) i pojedynczy bodziec CF, ponieważ drugi bodziec PF jest zbieżny z bodźcami CF przy 1 Hz przez 5 minut (Rysunek 1B).
- Protokół indukujący LTD 3
- Używając wewnętrznego roztworu opartego na elektrodzie Cs+ w warunkach zacisku napięcia, zastosuj podwójny bodziec PF (ISI 50 ms) i pojedynczy depolaryzujący krok napięcia (-70 do 0 mV, 50 ms) do somy przy 1 Hz przez 3 minuty, tak aby drugi bodziec PF był równoważny początkowi kroku napięcia depolaryzującego (Rysunek 1C).
- Protokół indukujący LTD-4
- Używając elektrody zawierającej wewnętrzny roztwór na bazie Cs+ w warunkach cęgów napięciowych, zastosuj bodźce PF (5x przy 100 Hz) i pojedynczy depolaryzujący krok napięcia (-70 do 0 mV, 50 ms) do somy przy 0,5 Hz przez 3 minuty, jednocześnie (Rysunek 1D).
