Model in vitro do badania przenikania patogenów przez barierę krew-mózg i infekcji komórek mózgowych

Streszczenie

Źródło: da Costa, A., i wsp. Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki i ich interakcji z mózgiem. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film przedstawia model in vitro do badania patogenów przekraczających barierę krew-mózg (BBB). Komórki śródbłonka mikronaczyniowego, które wyrażają ścisłe połączenia, tworzą warstwę śródbłonka w górnej komorze, podczas gdy neurony, astrocyty i mikroglej reprezentują miąższ mózgu w dolnej komorze, oddzielony porowatą błoną. Zakażenie wirusem w modelu BBB naśladuje patogen przechodzący z krwi do mózgu. Po wprowadzeniu wirusa neurotropowego przenika on przez barierę krew-mózg poprzez transcytozę, infekuje komórki nerwowe, replikuje się i uwalnia potomstwo wirusa, wykazując skuteczną neuroinwazję.

Protokół

1. Budowa i kontrola jakości BBB-Minibrain (bariera krew-mózg - Minibrain) (Rysunek 1)

1. Konfiguracja urządzenia do wkładania hodowli z membraną poliestrową BBB-Minibrain (Rysunek 1B)
   1. Hoduj linię komórkową śródbłonka ludzkiego mózgu (komórki hCMEC / D3) na 12-dołkowych filtrach do hodowli z membrany poliestrowej przez 6 dni na podłożu komórek śródbłonka przed użyciem ich w eksperymencie.
   2. Pokryj 12-dołkową płytkę poli-D-lizyną (1 ml / dołek, 10 μg / ml, 4 godziny w temperaturze pokojowej), a następnie lamininą (1 ml / dołek, 1 μg / ml, przez noc w temperaturze pokojowej).
   3. Usuń lamininę i dodaj 1 ml pożywki z komórek śródbłonka uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (5% pożywki z komórek śródbłonka).
   4. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności 95%.
   5. Delikatnie trypsynizuj post-mitotyczne ludzkie neurony (hNeurony) i ludzkie astrocyty (hAstrocyty) (NT2-N / A) oraz ludzką linię komórek mikrogleju (CHME / Cl5) i dysocjuj osady komórkowe z kompletnym podłożem komórek śródbłonka.
   6. Policz komórki, wymieszaj 3,6 x 10⁵ NT2-N/A i 0,4 x 10⁵ CHME/Cl5 komórek/studzienki i zasiej 12-dołkową płytkę.
   7. W T = 24 h (24 h po wysiewie): zmienić użytą pożywkę na świeżą kompletną pożywkę komórkową śródbłonka (komórki Minibrain i komórki śródbłonka) i przenieść filtr do hodowli z membraną poliestrową hCMEC/D3 na wierzch komórek Minibrain. Inkubować BBB-Minibrain w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności 95%.
      UWAGA: BBB-Minibrain będzie następnie składał się z warstwy ludzkich komórek śródbłonka hCMEC/D3 na filtrze izolującym przedział luminalny (lub przedział "krwi") oraz z mieszanej kultury ludzkich komórek hNT2-N/A i hCHME/Cl5 (Minibrain) na dnie studni definiującej przedział abluminalny (lub przedział "mózgowy") (Rysunek 1B).
2. Walidacja przepuszczalności śródbłonka BBB-Minibrain (kontrola jakości) (Rysunek 1C)
   1. Przygotować bufor transportowy (TB), który jest buforem HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) z Ca²⁺ i Mg²⁺ uzupełnionym 10 mM kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) i 1 mM pirogronianem sodu.
   2. Przygotować 12-dołkowe płytki z 1,5 ml buforu transportowego na studzienkę.
   3. Przy T = 0 należy utworzyć świeży bufor transportowy uzupełniony o 50 μM Lucyfer Yellow (LY-TB).
   4. Odwróć każdy filtr do góry nogami, aby ostrożnie usunąć pożywkę bez wpływu na barierę komórkową śródbłonka.
   5. Umieść filtr na napełnionej 12-dołkowej płytce i dodaj 0,5 ml LY-TB.
   6. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C, 5% CO₂ i wilgotności 95%.
   7. W T=10 min przenieś filtry na nowe 12-dołkowe płytki wypełnione TB i zachowaj komorę abluminalną pierwszej płytki do odczytu OD.
   8. Przy T= 25 min powtórzyć krok 1.2.7.
   9. Po T= 45 min należy przerwać transport, wyjmując filtry z płyt. Zachowaj przedziały abluminalne i oświetleniowe do pomiarów średnicy zewnętrznej.
   10. Przenieść próbki do ciemnych 96-dołkowych płytek: 10 μl z 190 μl TB dla LY-TB i komór luminalnych, 200 μl próbki dla komór abluminalnych.
   11. Zmierz fluorescencję LY-TB obecnego w różnych próbkach przy λ428 nm, λ535 nm (odpowiednio fale długości wzbudzenia i emisji).
   12. Oblicz przepuszczalność śródbłonka (Pe) w kierunku LY-TB (Pe_LY) za pomocą wzoru:
       1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) i Pe_LY= PSe/S.
       UWAGA: PSf to przepuszczalność filtra bez komórek, PSt to przepuszczalność filtra z komórkami, PSe to przepuszczalność monowarstwy śródbłonka w czasie powierzchni monowarstwy, S to powierzchnia monowarstwy (dla filtra 12-dołkowego = 1,12 cm²), Pe_LY jest wyrażona w cm/min. Dla hCMEC/D3 Pe_LY powinien wynosić od 0,7 do 1,2 x 10^-3 cm/min, w zależności głównie od FBS użytego w eksperymentach. Ważne: Pe_LY wyższy niż 1,2 oznacza, że BBB nie jest wystarczająco szczelny i można zaobserwować pewien wyciek. Odrzuć te bariery.

2. Zastosowanie BBB-Minibrain w celu podkreślenia obecności neuroinwazyjnych cząstek wirusowych w próbce szczepionki przeciwko wirusowi żółtej gorączki, francuskiemu wirusowi neurotropowemu, YFV-FNV 34 (Ryc. 2)

1. Krzyżowanie się BBB i namnażanie wirusów żółtej febry w Minibrain
   1. Należy użyć BBB-Minibrain przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 1.1.7 24 godziny przed dodaniem wirusa; zastąpić pożywkę 2% pożywką FBS z komórek śródbłonka.
      UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby unikać zmiany pożywki tuż przed dodaniem wirusa. Zmiana pożywki może aktywować ludzkie komórki śródbłonka i przejściowo otworzyć barierę, która umożliwi przejście wirusa. Tutaj podłoże jest zmieniane na 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu.
   2. Przy T = 0 bardzo ostrożnie dodać 3500 jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU) YFV-FNV rozcieńczonych w 50 μl 2% pożywki komórek śródbłonka FBS na górze komory luminalnej. Kontrolny BBB-Minibrain zaszczepia się 50 μl 2% pożywki z komórek śródbłonka FBS bez wirusa. Określ Pe_LY na studni towarzyszącej.
   3. Inkubuj BBB-Minibrain w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności 95%.
   4. Po 24 godzinach wyjąć urządzenie filtrujące z wkładkami do hodowli z membraną poliestrową i oznaczyć Pe_LY, pobrać 1 ml próbki z komory abluminalnej i miareczkować wirusa. Zastąp pożywkę świeżą 2% pożywką z komórek śródbłonka FBS.
   5. Inkubuj BBB-Minibrain w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności 95%.
   6. Po 72 godzinach pobrać próbkę pożywki z komory abluminalnej i miareczkować wirusa i/lub wyekstrahować RNA z komórek Minibrain do analizy ekspresji genów.

Wyniki

Rysunek 1: model BBB-Minibrain. A. Harmonogram hodowli hCMEC/D3 i zdjęcie urządzenia BBB-Minibrain: filtr z wkładkami do hodowli z membrany poliestrowej z barierą śródbłonkową hCMEC/D3 jest przytrzymywany kleszkiem przed włożeniem do jednego dołka na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. B. Rysunek opisujący urządzenie z przedziałem luminalnym (krwi) zawierającym barierę komórkow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 12-dołkowe	Corning	3336
Szalka Petriego 85mm	Sarstedt	83-3902-500
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	Na życzenie do dr Lafon
CMC	Calbiochem	217274
Ciemne płytki 96-dołkowe	Corning	3915
DMEM F12	Thermofisher Naukowy	31330-038
DMSO	Merck-Sigma Aldrich	D2650
Endogro IV	Milipore	SCME004
Etanol	Carlo Erba	529121
FBS	Hyklon	SV30015-04	pożywka komórkowa śródbłonka
HBSS z Ca2+-Mg2+	Thermofisher Naukowy	14025-100
hCMEC/D3	Cedarlan	CLU512
Hepes 1M	Thermofisher Naukowy	15630-070
Laminina	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-glutamina	Thermofisher Naukowy	25030-024
Lucyfer Żółty	Merck-Sigma Aldrich	L0259
MEM 10X	Thermofisher Naukowy	21430
MEM 1X	Thermofisher Naukowy	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
Paraformaldehyd	Mikroskopia elektronowa naukowa	15714
PBS bez Ca2+-Mg2+	Thermofisher Naukowy	14190
PBS-ca2+-MG2+	Thermofisher Naukowy	14040-091
Pióro/Paciorkowiec	Eurobio	CXXPES00-07
Poli-d-lizyna	Merck-Sigma Aldrich	P1149
Przedłuż złoto	Thermofisher Naukowy	P36930
Zestaw do oczyszczania RNA	QIAGEN	74104
Wodorowęglan sodu 5,6%	Eurobio	CXXBIC00-07
Pirogronian sodu	Thermofisher Naukowy	11360
Komórka T75 + kolba	Sarstedt	83-1813-302	Kolba polistyrenowa do hodowli tkankowych ze specjalną obróbką powierzchniową (Cell+) dla wrażliwych komórek przylegających
Transwell	Corning	3460	Wkładki do hodowli z porowatą membraną poliestrową
Trypsyna-EDTA	Merck-Sigma Aldrich	T3924
Ultra czysta woda	Thermofisher Naukowy	10977-035
Werset	Thermofisher Naukowy	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	Fiolka ze szczepionką