1. Przygotowanie much do eksperymentów MultiColor FlpOut (MCFO)
UWAGA: Technika MCFO odnosi się do zmodyfikowanej wersji tzw. wycięcia kasety zatrzymania za pośrednictwem Flp (FlpOut). Transgeniczne muchy MCFO przenoszą promotor szoku cieplnego (hsp)-rekombinazę Flp i różne reportery pod kontrolą sekwencji aktywacji (UAS). Każdy reporter składa się ze wspólnego szkieletu mirystoylowanego (myr) super folderowego białka zielonej fluorescencji (sfGFP), do którego wstawiono 10 kopii znacznika epitopu (e.g., HA, FLAG lub V5). Powstałe w ten sposób niefluorescencyjne białka nazywane są "spaghetti monster GFPs" (smGFPs) i mogą być wykrywane za pomocą specyficznych przeciwciał przeciwko różnym znacznikom epitopów.
- Przelatuje krzyżowo z kasetą MCFO i hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) do odpowiednich linii sterujących glejowych GAL4 (patrz Tabela materiałów).
- Ponieważ hsp jest już aktywny w temperaturze 25 °C i niewiele komórek może ulegać rekombinacji prowadzącej do niespecyficznego znakowania, należy ustawić krzyżówki w temperaturze 18 °C, aby uniknąć nieszczelności systemu. Odczekać około 20 dni w temperaturze 18 °C, aby uzyskać generację F1. Po szoku cieplnym (patrz krok 2) utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C (Rysunek 1).
2. Szok cieplny
UWAGA: W zależności od miejsca wprowadzenia, skuteczność hsp-Flp może się różnić; Dlatego należy zoptymalizować optymalny czas szoku cieplnego. Do tego protokołu użyto stada muchowego MCFO, w którym hsp-Flp został umieszczony na chromosomie X (patrz Tabela materiałów).
- Przenieść potomstwo z krzyżówki w kroku 1.1 (muchy pokolenia F1, w wieku 3-4 dni) do nowych fiolek zawierających pokarm i poddać je szokowi termicznemu w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
UWAGA: Młode muchy (w wieku 1-2 dni) są bardzo wrażliwe na szok cieplny. Odczekaj jeszcze 1 lub 2 dni przed wykonaniem szoku cieplnego, aby zmniejszyć śmiertelność spowodowaną leczeniem. Użyj niektórych much generacji F1 jako kontroli, bez szoku cieplnego.
- Podczas szoku cieplnego utrzymuj muchy w normalnych fiolkach z jedzeniem, aby zmniejszyć śmiertelność wywołaną stresem. Umieścić samice i samce w oddzielnych fiolkach.
- Upewnij się, że zanurzyłeś całą fiolkę w wodzie, aby zapewnić jednorodny szok cieplny. Użyj 5-8-minutowego wstrząsu jako odpowiedniego punktu wyjścia do rzadkiego znakowania komórek glejowych wieloma liniami sterownika GAL4; Czas trwania wstrząsu musi być zoptymalizowany dla każdego kierowcy i eksperymentu (może być konieczne krótsze lub dłuższe czasy szoku cieplnego).
- Po szoku cieplnym połóż fiolki poziomo na ławce na kilka minut, aby muchy mogły dojść do siebie po szoku cieplnym.
UWAGA: Nie ma potrzeby wymiany fiolek.
- Utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C i poddaj je sekcji (patrz krok 3 i 4) 2 lub więcej dni po szoku cieplnym, aby uzyskać optymalną ekspresję reportera.
3. Przygotowanie i roztwory do sekcji
- W dniu sekcji należy przygotować świeży roztwór utrwalający w probówkach PCR o pojemności 200 μl, mieszając 180 μl pożywki do hodowli komórek S2 z 20 μl 20% paraformaldehydu (PFA) w celu uzyskania 2% roztworu PFA. Utrzymuj roztwór utrwalający na lodzie przed i w trakcie sekcji.
Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
UWAGA: Wymieszaj 160 μl pożywki do hodowli komórkowej S2 z 40 μl 20% paraformaldehydu (PFA) w probówce 200 μl reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby przygotować 4% roztwór PFA zamiast 2% roztworu.
- Użyj jednej probówki PCR na genotyp z maksymalnie 8-10 mózgami na probówkę, aby uzyskać optymalne wyniki barwienia.
- Przygotuj roztwór do płukania mózgu dla dorosłych: 0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 0,5% Triton X-100 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
UWAGA: W zależności od barwienia może być potrzebny roztwór zawierający 1% Triton X-100. Wyższe stężenie Triton X-100 zwiększa przenikanie przeciwciała do tkanki i konieczne jest zabarwienie obszarów leżących głęboko w tkance ( np. regionów synaptycznych w mózgu dorosłego Drosophila).
- Przygotuj roztwór blokujący: 3% normalnej surowicy koziej, 3% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 w PBS.
- Roztwór do przemywania mózgu dla dorosłych i roztwór blokujący mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
- Umieść szklaną płytkę studni głębinowej na lodzie i napełnij każdą studzienkę następującymi roztworami: jedną z 70% etanolem, jedną z PBS i jedną z pożywką do hodowli komórek S2.
4. Sekcja mózgu dorosłego
- Umieść 3-centymetrową naczynie preparacyjne na stoliku mikroskopu stereoskopowego i napełnij je zimnym podłożem do hodowli komórek S2. Przeprowadzić wszystkie sekcje w tym podłożu, aby upewnić się, że tkanka pozostaje zdrowa podczas procedury preparacji.
UWAGA: Użyj naczynia preparacyjnego wyłożonego kilkoma milimetrami czarnego silikonu, który zapewnia dobry kontrast tła (na zdjęciach) i zachowaj kleszcze podczas sekcji.
- Znieczulij muchy o pożądanym genotypie za pomocą CO2.
- Za pomocą kleszczy złap muchę za skrzydła i umyj ją w zimnym 70% etanolu przez 30 s, a następnie zimnym PBS przez dodatkowe 30 s.
- Przenieś muchę do głębokiego zagłębienia, które jest wypełnione pożywką do hodowli komórek S2.
- Powtórz tę samą procedurę dla wszystkich much o tym samym genotypie i utrzymuj je w zimnej pożywce do hodowli komórek S2 aż do rozwarstwienia, co pozwoli zachować tkankę.
UWAGA: Znieczulaj tylko tyle much, ile można wypreparować w czasie około 30 minut. Długi czas inkubacji w pożywce do hodowli komórek S2 może uszkodzić tkankę.
- Chwyć muchę kleszczami i pod mikroskopem stereoskopowym zanurz muchę w pożywce do hodowli komórek S2.
- Odłącz głowę od reszty ciała. Wyrzuć ciało i trzymaj głowę zanurzoną w pożywce do hodowli komórek S2. Niezwykle ważne jest, aby przez cały czas trwania sekcji trzymać głowę kleszczami. Jeśli głowa zacznie unosić się na wodzie, trudno będzie ją odzyskać bez uszkodzenia tkanki.
- Rozpocznij sekcję od wyciągnięcia jednego oka, cały czas trzymając głowę co najmniej jednym kleszczem. Upewnij się, że końcówka kleszczyków znajduje się tuż pod siatkówką, aby uniknąć uszkodzenia tkanki pod spodem. Wyciągnij drugie oko i zacznij usuwać naskórek, aż pojawi się mózg.
- Usuń całą tkankę tchawicy i naskórek wokół mózgu, aż tkanka będzie wyglądać na czystą. Upewnij się, że usunąłeś całą tkankę tchawicy wokół mózgu, aby uzyskać optymalne wyniki barwienia; Tkanki są teraz gotowe do utrwalenia i wybarwienia.
- Utrzymuj wszystkie wypreparowane mózgi w zimnej pożywce do hodowli komórek S2 przed przeniesieniem ich do roztworu PFA, aby określić czas etapu utrwalania.
5. Barwienie mózgu osoby dorosłej
- Przenieś izolowany mózg za pomocą pipety P10 do roztworu PFA w temperaturze pokojowej (RT). Aby uniknąć uszkodzenia tkanek, nigdy nie używaj kleszczy do przenoszenia mózgu po sekcji. Wykonaj wszystkie kroki w probówkach PCR o pojemności 200 μl na nutatorze.
- Na wszystkich etapach, przed wyrzuceniem starego roztworu za pomocą pipety P200, pozwól mózgom osiąść na dnie probówki. Spróbuj usunąć supernatant bez zasysania tkanki. Chroń tkankę przed ekspozycją na światło.
- Utrwal mózgi w 200 μl 2% PFA w pożywce do hodowli komórek S2 przez 1 godzinę lub w 4% PFA przez 30 minut. Utrzymuj identyczne czasy utrwalania między próbkami w celu zwiększenia odtwarzalności.
- Po 3 (lub więcej) płukaniach po 15 minut każde w 200 μl roztworu do przemywania mózgu osoby dorosłej, zablokuj tkanki 200 μl roztworu blokującego na 30 minut. Możliwe są dłuższe czasy inkubacji w roztworze blokującym.
- Inkubować mózgi przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze do przemywania mózgu dla dorosłych w całkowitej objętości 200 μL.
UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od rodzaju użytego przeciwciała. Mogą być konieczne dłuższe inkubacje.
- W celu znakowania trzech markerów MCFO należy inkubować mózgi z przeciwciałami pierwszorzędowymi anty-HA (1:500), anty-FLAG (epitop DYKDDDDK) (1:100) i anty-V5.
- Pierwszorzędowe przeciwciała bezpośrednio sprzężone mogą być stosowane zamiast normalnej kombinacji pierwszorzędowej + drugorzędowej (e.g., anty-V5:DyLight 549 (1:200)). W takim przypadku należy traktować przeciwciała bezpośrednio sprzężone jako przeciwciała drugorzędowe.
UWAGA: Dla każdego genotypu, zachowaj kilka mózgów jako kontrolę, aby zweryfikować specyficzność barwienia. Pomiń inkubację przeciwciał pierwotnych i przejdź bezpośrednio do następnego kroku.
- Przemyć tkanki 3 razy przez 1 godzinę w 200 μl roztworu do przemywania mózgu dla dorosłych (krok 3.3) i inkubować je z drugorzędowymi koniugatami fluoroforowymi/pierwszorzędowymi przeciwciałami bezpośrednio sprzężonymi, rozcieńczonymi w roztworze do przemywania mózgu dla dorosłych przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, w całkowitej objętości 200 μL
UWAGA: Przykłady odpowiednich przeciwciał: AlexaFluor 488 (1:250), przeciwciała sprzężone anty-V5:DyLight 549 (1:200) i DyLight 647 (1:100).
- Umyć mózgi 3 razy przez 1 godzinę w 200 μl roztworu do przemywania mózgu dla dorosłych, a następnie przepłukać końcowo w 200 μl PBS przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej; Ostatni etap mycia w PBS usuwa wszelkie ślady Triton X-100 i jest niezbędny do uzyskania optymalnych rezultatów barwienia. Zamontuj mózgi w podłożu montażowym za pomocą środka zapobiegającego blaknięciu na szklanych szkiełkach nakrywkowych.
6. Montaż mózgów do obrazowania
- Przytnij przekładkę obrazową do odpowiedniego rozmiaru za pomocą nożyczek. W przypadku mikroskopii o wysokiej rozdzielczości umieść próbkę i przekładkę obrazową między dwoma szklanymi szkiełkami nakrywkowymi.
UWAGA: Dystanse obrazowania to cienkie (0,12 mm grubości) samoprzylepne przekładki, które odklejają się i przyklejają do szklanych szkiełek nakrywkowych lub szkiełek mikroskopowych, umożliwiając mocowanie próbek bez kompresji.
- Za pomocą kleszczyków usuń samoprzylepną wyściółkę z jednej powierzchni i nałóż przekładkę klejem do dołu na powierzchnię szklanego szkiełka nakrywkowego (22 mm x 60 mm). Nanieść 10 μl podłoża mocującego na nowe szklane szkiełko nakrywkowe.
- Za pomocą pipety P10 przenieś mózgi z probówki o pojemności 200 μl do szkiełka nakrywkowego, obok kropli podłoża mocującego. Wraz z tkankami przenieś trochę PBS, aby utrzymać mózg w roztworze.
- Za pomocą pipety P10 przenieś mózgi z PBS do kropli podłoża mocującego, próbując ograniczyć ilość PBS. Przenieść próbki w podłożu montażowym na szkiełko nakrywkowe za pomocą przekładki obrazowej. Użyj wystarczającej ilości nośnika montażowego, aby przykryć próbkę.
- Usuń drugą wkładkę samoprzylepną z górnej strony przekładki i dodaj szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbek. Końcówką kleszczy delikatnie dociśnij obszar kleju, aby uszczelnić. Natychmiast zobrazuj zamontowane tkanki lub przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.
