Barwienie immunofluorescencyjne mózgów Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych

Streszczenie

Źródło: Batelli, S., et al. Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania morfologii pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości i interakcji komórkowych gleju u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne transgenicznego mózgu Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych. Mózg wykazuje ekspresję białek ukierunkowanych na błonę, połączonych z różnymi kombinacjami epitopów antygenowych pod kontrolą specyficznego dla gleju systemu rekombinazy. Wyizolowane i utrwalone mózgi są barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla epitopów antygenowych, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Znakowanie to umożliwia jednoczesne obrazowanie różnych subpopulacji komórek glejowych w różnych regionach mózgu.

Protokół

1. Przygotowanie much do eksperymentów MultiColor FlpOut (MCFO)

UWAGA: Technika MCFO odnosi się do zmodyfikowanej wersji tzw. wycięcia kasety zatrzymania za pośrednictwem Flp (FlpOut). Transgeniczne muchy MCFO przenoszą promotor szoku cieplnego (hsp)-rekombinazę Flp i różne reportery pod kontrolą sekwencji aktywacji (UAS). Każdy reporter składa się ze wspólnego szkieletu mirystoylowanego (myr) super folderowego białka zielonej fluorescencji (sfGFP), do którego wstawiono 10 kopii znacznika epitopu (e.g., HA, FLAG lub V5). Powstałe w ten sposób niefluorescencyjne białka nazywane są "spaghetti monster G....

Wyniki

Rysunek 1: Schemat krzyżowania dla techniki MCFO. Schemat techniki MCFO. Homozygotyczne dziewice noszące kasetę MCFO i hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) krzyżuje się ze specyficznymi homozygotycznymi samcami kierowcy GAL4. Pokolenie F1 jest wtedy w szoku cieplnym. W zależności od liczby kaset FRT-stop-FRT wyjmowan.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kąpiel wodna	Dotacja	GD100
Probówki do PCR	Sarstedt	72.737.002
Kleszcze	Dumont	11251-20
Naczynie preparacyjne 30 mm x 12 mmm	Mikroskopia elektronowa Nauka	70543-30	Szklane naczynie preparacyjne
Szklana płyta punktowa Pyrex 3 Depression	Corning	7223-34	Szklane płytki preparacyjne
Sylgard Czarny	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	domowej roboty z węgla drzewnego
Pożywka do hodowli komórkowych ExpressFive S2	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Mikroskopia elektronowa	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Normalna kozia surowica	Laboratoria Jacksona	005-000-121
Normalna surowica osła	Laboratoria Jacksona	017-000-121
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A9647
Królik HA-tag	Sygnalizacja komórkowa	C29F4	Przeciwciało pierwotne, rozcieńczenie 1:500
Szczur FLAGA-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Przeciwciało pierwotne, rozcieńczenie 1:100
Mysz V5-tag:DyLight 549	AdSerotec	411	Przeciwciało sprzężone, rozcieńczenie 1:200
przeciw królikowi AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczenie 1:250
przeciw szczurom DyLight 647	Laboratoria Jacksona	712-605-153	Przeciwciało wtórne, rozcieńczenie 1:100
Tarcza Vecta	Laboratoria wektorowe	H-1000
Złoto SlowFate	Invitrogen	S36937
Bezpieczna przekładka uszczelki	Grace Biolabs		Skontaktuj się z firmą w celu złożenia zamówienia
Szklana osłona mikroskopu 22 X 60 mm	Marienfeld	101152
Szklana osłona mikroskopu 22 x 22 mm	Roth	H874
Mikroskop stereoskopowy, Leica MZ6	Leica
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 f	Olejek immersyjny do mikroskopii fluorescencyjnej, bezhalogenowy
Immersol	Zeiss	W 2010	Płyn zanurzeniowy do obiektywów zanurzonych w wodzie, bezhalogenowy
R56F03-GAL4 (EG)	Centrum Akcji w Bloomington	39157	Sterownik GAL4
R86E01-GAL4 (ALG)	Centrum Magazynowe w Bloomington	45914	Sterownik GAL4
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAGA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Centrum Magazynowe w Bloomington	64085	Reporter UAS (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Makro wieloczasowe	Zeiss		Oprogramowanie do automatycznego skanowania