Dzień 1
1. Znakowanie mitochondriów mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC)
- Dwa dni przed przygotowaniem mitochondriów należy wysiać ludzkie MSCs w 100-milimetrowej naczyniu cultAure, w 10 ml (Minimum Essential Medium Eagle)/FBS (płodowa surowica bydlęca) 10%, tak aby w dniu 1 w kulturze znajdowały się 4 x 105 MSC.
- Przepłukać MSCs PBS (4 ml) i dodać 4 ml αMEM/FBS 1% (podgrzane do 37 °C).
- Dodać wymaganą ilość barwnika witalnego mitochondriów i inkubować komórki przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
- Usunąć roztwór barwnika mitochondriów, dwukrotnie przepłukać komórki 4 ml podgrzanego (37 °C) αMEM/FBS 1% i dodać z powrotem 4 ml αMEM/FBS 10%. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C.
- Zmienić pożywkę hodowlaną (10 ml αMEM/FBS 10%) po 30 minutach, a innym razem 2 godziny później.
Dzień 1
2. Znakowanie komórek macierzystych glejaka (GSC)
- Dysocjacja linii komórkowej GSC Gb4 (10 x 106 komórek) wyhodowanych jako neurosfery na kolbach do hodowli komórkowych pokrytych poli-HEMA
- Nasiona GSC w 48-dołkowej płytce w10-5 komórkach/baseniku w pożywce proliferacyjnej GSC (500 μl) (patrz Tabela 1).
- Odwirować płytkę o masie 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
- Dodać wymaganą ilość barwnika do czynności życiowych komórek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Dodać 500 μl podłoża podstawowego GSC (Tabela 1) na dołek płytki 48-dołkowej.
- Odwirować płytkę przy 270 x g w temperaturze 20 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.
- Powtórz kroki od 2.5 do 2.6.
- Dodać 500 μl pożywki podstawowej GSC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Odwirować płytkę przy 270 x g w temperaturze 20 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.
- Dodać 500 μl pożywki do proliferacji GSC na dołek płytki 48-dołkowej i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
nuta: Wskazana ilość GSC (10 x 10,6 komórek) pozwala na przeprowadzenie różnych eksperymentów dawka-odpowiedź i kontroli FACS. Po dokładniejszym określeniu warunków eksperymentalnych wielkość ta może zostać zmniejszona.
3. Wysiewanie komórek macierzystych glejaka
- Zebrać neurosfery GSC (Glejak macierzysty) (10 x 106 komórek) przez odwirowanie w temperaturze 270 x g przez 5 minut, w temperaturze 20 °C w probówce o pojemności 50 ml.
- Umyć komórki 5 ml HBSS (Zbilansowanego Roztworu Soli Hanksa) i odwirować przy 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
- Odessać supernatant.
- Delikatnie zawiesić osad GSC w 100 μl trypsyny-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) (0,25%) (na 10 x 106 komórek)
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
- Dodać 10 μl CaCl2 (20 mM) i 2 μl DNazy I (10 mg/ml).
- Oddziel neurosfery, delikatnie pipetując w górę i w dół (30-50x) za pomocą pipety P200. Unikaj bąbelków. Sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie GSC są zdysocjowane.
- Dodać 10 μl inhibitora trypsyny (5%) i 10 ml HBSS.
- Odwirować GSC przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.
- Odrzucić sklarowany osad i dodać 10 ml pożywki podstawowej GSC.
- Policzyć GSC w komorze liczącej Thoma, a następnie odwirować komórki przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.
- Dodać odpowiednią objętość pożywki do proliferacji GSC, aby osiągnąć stężenie komórkowe 10-6 GSC/ml.
- Wysiew 105 GSC (100 μl zawiesiny komórkowej) na basenik płytki 96-dołkowej.
- Odwirować płytki o sile 270 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C, aby na dnie studzienek znalazły się GSC.
- Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C.
Dzień 2
4. MSC (Mezenchymalne komórki macierzyste) Izolacja mitochondriów
- Ustawić temperaturę wirówki z mikroprobówkami na 4 °C.
- Przygotować dwie probówki "A" i "C" o pojemności 1,5 ml zawierające odczynniki do ekstrakcji mitochondriów (200 μl odczynnika A i 400 μl odczynnika C, obie zawierające inhibitory proteazy wolne od EDTA). Przygotuj 2 inne probówki, oznaczone "MSC" i "Mito". Trzymaj wszystkie probówki na lodzie. Przygotuj również probówki do seryjnych rozcieńczeń mitochondriów.
- Przemyć MSC 10 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
- Przemyj MSCs 2 ml trypsyny (bez EDTA) przez 10 sekund i dodaj 1 ml trypsyny (bez EDTA). Inkubować komórki przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.
- Odzyskaj MSC, dodając 10 ml αMEM /FBS 10%, przenosząc do probówki o pojemności 50 ml.
- Odwirować komórki przy 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
- Odrzucić supernatant i dodać 10 ml αMEM/FBS 10% do osadu komórkowego.
- Policz MSC za pomocą komory liczącej Malassez.
- Odwirować MSC (4-5 x 105) przy 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
- Odrzuć supernatant, dodaj 1 m lodowaty αMEM/FBS 10% do osadu komórkowego i przenieś komórki do probówki z oznaczeniem "MSC". Trzymaj probówkę na lodzie.
- Odwirować probówkę zawierającą MSCs o sile 900 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
- Usuń wszystkie resztki pożywki z probówki.
- Dodać 200 μl odczynnika A do izolacji mitochondriów (zawierającego inhibitory proteazy wolne od EDTA). Wiruj ze średnią prędkością przez 5 sekund i pozostaw rurki na lodzie dokładnie na 2 minuty.
- Dodać 2,5 μl odczynnika do izolacji mitochondriów B. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund, a następnie pozostawić probówki na lodzie. Powtarzaj co 30 sekund przez 5 minut.
- Dodać 200 μl odczynnika C do izolacji mitochondriów (zawierającego inhibitory proteazy wolne od EDTA). Wymieszaj, przechylając rurkę (około 30 razy, nie wirować). Odwirować probówkę o sile 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Przenieść supernatant (zawierający mitochondria MSC) do probówki "Mito".
- Odwirować przy 3 000 x g, 15 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad mitochondriów. Odrzucić supernatant. Osad zawiera izolowane mitochondria.
- Przepłukać osad mitochondriów 200 μl odczynnika C. Następnie odwirować przy 12 000 x g, 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad mitochondriów.
5. Transfer izolowanych mitochondriów MSC do GSC (MitoCeption)
- Dodać 200 μl wstępnie schłodzonej (0 °C) pożywki do proliferacji GSC do osadu mitochondriów wyizolowanego z MSCs (4 x 105).
- Rozcieńczyć preparat mitochondriów (w pożywce proliferacyjnej GSC), aby konsekwentnie dodawać 20 μl zawiesiny mitochondrialnej do GSC.
- Dodać objętość wyizolowanych mitochondriów do studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej GSC w żądanym stężeniu (0,1 do 10 μg). Dodawaj mitochondria powoli, blisko dna studzienki, pokrywając przynajmniej raz całą powierzchnię.
- Odwirować 96-dołkową płytkę zawierającą biorcze GSC mitochondriów z mitochondriami MSC i płytką kontrolną przy 1 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Umieścić płytki hodowlane w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C natychmiast po odwirowaniu.
nuta: Protokół transferu mitochondriów opiera się na odwirowaniu zawiesiny mitochondriów na hodowanych komórkach przy odpowiedniej sile wirowania, z liczbą wirowań, które można dostosować w zależności od systemu komórek dawcy/biorcy mitochondriów.
Tabela 1: Pożywki hodowlane.
| Pożywka do hodowli komórkowych | kompozycja |
| Podłoże podstawowe GSC | DMEM/F-12 uzupełniony o |
| Insulina 20 mg/ml |
| Suplement N2 1x |
| Glukoza 3 g/L |
| L-glutamina 2 mM |
| Medium proliferacyjne GSC | Dodaj do podłoża podstawowego: |
| B27 suplement 1x |
| EGF 10 ng/ml |
| bFGF 10 ng/ml |
| Grzyb 10 mg/ml |
| Fungizon 0,25 mg/ml |
| Heparyna 2 mg /ml |
| Ciprofloksacyna 2 μg / ml |
| Gentamycyna 2 μg/ml |
| Medium proliferacyjne MSC | αMEM uzupełniony o |
| L-glutamina 2 mM |
| 10% FBS |
| bFGF 2 ng/ml |
