Analiza ilościowa uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach ziarnistych móżdżku przy użyciu barwników FM

Summary

Opisano technikę obrazowania fluorescencji na żywo do ilościowego określania uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Dwie rundy recyklingu SV są monitorowane w tych samych zakończeniach nerwowych, zapewniając kontrolę wewnętrzną.

Abstract

Po uwolnieniu neuroprzekaźnika w centralnych zakończeniach nerwowych, SV są szybko odzyskiwane przez endocytozę. Odzyskane SV są następnie ponownie napełniane neuroprzekaźnikiem i ponownie dołączają do puli recyklingu, zdefiniowanej jako SV, które są dostępne dla egzocytozy^1,2. Pulę recyklingu można zasadniczo podzielić na dwie odrębne pule - pulę łatwo uwalnialną (RRP) i pulę rezerwową (RP). Jak sugerują ich nazwy, RRP składa się z SV, które są natychmiast dostępne do fuzji, podczas gdy RP SV są uwalniane tylko podczas intensywnej stymulacji^1,2. Ważne jest, aby mieć wiarygodny test, który informuje o zróżnicowanym uzupełnianiu tych pul SV, aby zrozumieć: 1) w jaki sposób SV przemieszczają się po różnych trybach endocytozy (takich jak endocytoza zależna od klatryny i endocytoza masowa zależna od aktywności) oraz 2) mechanizmy kontrolujące mobilizację zarówno RRP, jak i RP w odpowiedzi na różne bodźce.

FM barwniki są rutynowo używane do ilościowego raportowania obrotu SV w centralnych zakończeniach nerwowych^3-8. Mają hydrofobowy ogon węglowodorowy, który umożliwia odwracalny podział w dwuwarstwie lipidowej, oraz hydrofilową grupę główną, która blokuje przejście przez błony. Barwniki mają niewielką fluorescencję w roztworze wodnym, ale ich wydajność kwantowa dramatycznie wzrasta po podziale na błony⁹. Dzięki temu barwniki FM są idealnymi sondami fluorescencyjnymi do śledzenia aktywnego recyklingu SV. Standardowy protokół stosowania barwnika FM jest następujący. Najpierw są one nakładane na neurony i są pobierane podczas endocytozy (ryc. 1). Po tym, jak niezinternalizowany barwnik zostanie wypłukany z błony plazmatycznej, przetworzone SV są redystrybuowane w puli recyklingu. Te SV są następnie wyczerpywane za pomocą bodźców rozładowujących (ryc. 1). Ponieważ znakowanie SV barwnikiem FM jest kwantyczne¹⁰, wynikający z tego spadek fluorescencji jest proporcjonalny do ilości uwolnionych pęcherzyków. W ten sposób recykling i fuzja SV wygenerowanych z poprzedniej rundy endocytozy może być wiarygodnie określona ilościowo.

Tutaj prezentujemy protokół, który został zmodyfikowany w celu uzyskania dwóch dodatkowych elementów informacji. Po pierwsze, sekwencyjne bodźce rozładowujące są wykorzystywane do zróżnicowanego rozładowywania RRP i RP, aby umożliwić ilościowe określenie uzupełniania określonych pul SV. Po drugie, każde zakończenie nerwowe poddawane jest protokołowi dwukrotnie. W ten sposób odpowiedź tego samego zakończenia nerwowego w S1 może być porównana z obecnością substancji badanej w fazie S2 (ryc. 2), zapewniając kontrolę wewnętrzną. Jest to ważne, ponieważ zakres recyklingu SV w różnych zakończeniach nerwowych jest bardzo zmienny¹¹.

Do tego protokołu można użyć dowolnych przylegających pierwotnych kultur neuronalnych, jednak gęstość posiewu, roztwory i warunki stymulacji są zoptymalizowane dla neuronów ziarnistych móżdżku (CGN)^12,13.

Protocol

1. Preparat neuronu granulatu móżdżku

1. W autoklawie należy umieścić około 100 szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 mm (tabela 1).
2. Umieścić szkiełka nakrywkowe w sterylnej probówce o pojemności 50 ml zawierającej sterylny roztwór poli-D-lizyny (Tabela 2). Umieść na obrotowej platformie na 2 godziny, aby pokryć szkiełka nakrywkowe.
3. Suche powlekane szkiełka nakrywkowe na sterylnej bibułce w kapturze z przepływem laminarnym (Tabela 1).
4. Umieścić szkiełka nakrywkowe w sterylnych płytkach 6-dołkowych i ogrzać w inkubatorze CO₂ (Tabela 1). Szkiełka nakrywkowe można przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4°C przed użyciem.
5. Poddaj eutanazji 7-dniowe szczenię szczura Sprague Dawley zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji etycznej. Przeprowadziliśmy eutanazję szczeniąt za pomocą zwichnięcia szyjki macicy.
6. Rozciąć móżdżek i umieścić go na sterylnej szalce Petriego zawierającej buforowany roztwór soli fosforanowych (roztwór B, tabela 3).
7. Powtórz kroki 1.5 i 1.6 dla 4-6 szczeniąt szczurów.
8. Móżdżek jest następnie umieszczany na sterylnym etapie rozdrabniacza tkanek McIlwaina (Tabela 1). Tkanka jest rozdrabniana w odstępach 375 μm, a następnie obracana o 90° i powtarzana proces.
9. Rozdrobniony móżdżek przenosi się do roztworu trypsyny (roztwór T, tabela 4), który został uprzednio podgrzany do temperatury 37 °C.
10. Inkubować móżdżek w temperaturze 37 °C przez 20 minut, delikatnie mieszając mniej więcej co 5 minut.
11. Podczas trawienia tryptycznego wypoleruj płomieniowo trzy sterylne szklane pipety (Tabela 1) za pomocą płomienia Bunsena. Użyj płomienia, aby uzyskać drobny, średni otwór i szeroki otwór przy odpowiednich wylotach pipet.
12. Po 20 minutach inkubacji w roztworze T dodać 20 ml roztworu trypsyny / inhibitora DNazy (roztwór W, tabela 5) do zawiesiny móżdżku i komórek osadu w ilości 1 000 g przez 1 minutę w wirówce stołowej (tabela 1).
13. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1,5 ml stężonego inhibitora trypsyny / DNazy (roztwór C, tabela 6) przy użyciu pipety o najszerszym otworze.
14. Rozcierać komórki, używając najpierw pipety o szerokim otworze, następnie średniej średnicy, a na końcu wąskiego otworu, aż zawiesina komórki będzie jednorodna. Jest to kluczowy krok, na tym etapie zawieszenie musi być jednorodne.
15. Zawiesinę komórkową należy nałożyć na 10 ml wstępnie podgrzanego (37°C) roztworu soli Earlesa (Tabela 7) w sterylnej probówce o pojemności 15 ml z albuminą bydlęcą uzupełnioną (Tabela 7).
16. Odwirować zawiesinę przez 5 minut przy sile 1 500g i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml wstępnie podgrzanej (37°C) pożywki hodowlanej (Tabela 8).
17. Oszacuj liczbę komórek za pomocą hemocytometru (Tabela 1) i rozcieńcz zawiesinę komórek do końcowej gęstości 3,3 x 10⁶ komórek na ml.
18. Komórki posiewa się przez dodanie 75 μl zawiesiny komórek do środka szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną (gęstość końcowa 2,5 x 10⁵).
19. Płytki hodowlane zawierające szkiełka nakrywkowe umieszcza się w inkubatorze CO₂ na 60 minut, aby umożliwić przyleganie komórek.
20. Dodać 1,5 ml pożywki hodowlanej do każdej studzienki, uważając, aby nie naruszyć posianych komórek, a następnie włożyć płytki hodowlane z powrotem do inkubatora CO₂ .
21. Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną świeżą pożywką z dodatkiem inhibitora mitotycznego arabinozydu cytozyny (Tabela 8). To hamuje proliferację komórek glejowych w hodowli.

2. Konfiguracja eksperymentalna

1. Podstawowa konfiguracja doświadczalna powinna składać się z następujących elementów (zob. tabele 1 i 9 w odniesieniu do konkretnego używanego sprzętu i oprogramowania):
   • Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny
   • Chłodzona kamera CCD
   • Fluorescencyjne źródło światła (monochromator lub koło filtrów)
   • Aparat do perfuzji grawitacyjnej
   • Komora obrazowania z równoległymi elektrodami platynowymi
   • Stymulator elektryczny
   • komputer
   • Oprogramowanie do akwizycji obrazów
2. Eksperymenty należy przeprowadzać w ciemności lub w warunkach czerwonego światła przy minimalnym oświetleniu fluorescencyjnym próbki, aby uniknąć wybielania barwnikiem FM.
3. Eksperymenty przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Jeśli wymagana jest temperatura fizjologiczna, można zastosować system perfuzyjny o kontrolowanej temperaturze.

3. Przygotowanie próbki

1. Kultury należy stosować po 8-12 dniach in vitro.
2. Przenieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe do roztworu soli (tabela 10) na 10 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić stabilizację w nowym podłożu.
3. Zdejmij szkiełko nakrywkowe, osusz jego spód i obszar otaczający przyczepione komórki małym kawałkiem ręcznika papierowego lub chłonnego papieru.
4. Za pomocą smaru silikonowego (Tabela 2) przyklej szkiełko nakrywkowe do spodu komory obrazowania. Ogniwa powinny znajdować się między dwoma równoległymi przewodami. Do całkowitego uszczelnienia komory należy użyć wystarczającej ilości smaru silikonowego, ale bez przedostawania się smaru do środka komory kąpieli.
5. Delikatnie napełnij komorę kąpieli ~260 μl roztworu soli fizjologicznej, a następnie napełnij rurkę wejściową tym samym roztworem.
6. Przyklej czyste szkiełko nakrywkowe smarem silikonowym do górnej części komory, aby je uszczelnić. Rurki wejściowe i wyjściowe mogą być używane do usuwania wszelkich pęcherzyków powietrza uwięzionych w komorze. Ważne jest, aby obwód elektryczny nie był przerywany przez pęcherzyki powietrza.
7. Unieruchomić komorę obrazowania na platformie ze stali nierdzewnej i sprawdzić, czy nie ma wycieków, delikatnie przepuszczając roztwór soli fizjologicznej przez rurkę wejściową.
8. Zamontuj zmontowaną komorę na stoliku mikroskopu odwróconego i podłącz komorę do grawitacyjnego systemu perfuzyjnego, po uprzednim zalaniu wlotu roztworem soli fizjologicznej.
9. Podłącz przewody łączące komorę do stymulatora elektrycznego.
10. Dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu, jeśli używana jest soczewka olejowa. Skoncentruj się na komórkach w środku komory, używając jasnego oświetlenia pola.

4. Faza S1

1. Perfuzjować neurony za pomocą 1,5 ml barwnika FM (Tabela 2) rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej.
2. Stymuluj neurony do wywołania wychwytu barwnika za pomocą dołączonego stymulatora.
3. Po stymulacji perfuzjuj neurony świeżym roztworem soli fizjologicznej przez 2 minuty, aby zmyć nadmiar barwnika FM (szybkość przepływu 7 ml / min). Zanieczyszczenie glejowe w systemie hodowli CGN wynosi mniej niż 5%¹⁴, dlatego ten czas jest wystarczający do usunięcia barwnika.
4. Pozostaw neurony na odpoczynek na 8 minut.
5. W tym czasie zlokalizuj sieci aksonalne, w których widoczne są poszczególne zakończenia nerwowe obciążone barwnikiem FM, używając długości fal fluoresceiny (wzbudzenie, 480 nm; emisja, > 550 nm). Unikaj obszarów z klastrami komórek. Na tym etapie ogranicz oświetlenie do minimum, ponieważ intensywne wzbudzenie może spowodować fototoksyczność barwnika. Oczywistymi oznakami tego są pęcherzyki aksonów i brak odprowadzania barwnika (z powodu utrwalania barwnika).
6. Ponownie ustaw ostrość obrazu bezpośrednio przed uzyskaniem obrazu, ponieważ w okresie odpoczynku mogło wystąpić niewielkie odchylenie.
7. Rozpocznij akwizycję obrazu poklatkowego z szybkością 1 klatki co 4 s.
8. Po uzyskaniu 5-10 obrazów wyjściowych wywołaj egzocytozę RRP, dostarczając stymulację 30 Hz przez 2 s (60 potencjałów czynnościowych)⁸. Rozpocznij stymulację ręcznie natychmiast po przechwyceniu klatki.
9. Po uzyskaniu kolejnych 10 obrazów wywołaj egzocytozę SV RP za pomocą trzech stymulacji 40 Hz przez 10 s (400 potencjałów czynnościowych), każda w odstępie 30 s⁸.
10. Zdobądź kolejne 5–10 obrazów, a następnie wstrzymaj ich pozyskiwanie.

5. Faza odzyskiwania (patrz Rysunek 2)

1. Pozwól neuronom zregenerować się przez co najmniej 20 minut.
2. Opcjonalnie - Jeśli ma być badany wpływ leku na endocytozę, w tym okresie należy wykonać perfuzję neuronów roztworem leku (ryc. 2b) ^3,8.

6. Faza S2

1. Powtórzyć protokół fazy S1 (sekcja 4) dla eksperymentu kontrolnego z wykorzystaniem tego samego pola widzenia, co w S1.
2. Opcjonalnie - Jeśli ma być badany wpływ leku na endocytozę, należy przeprowadzić perfuzję neuronów roztworem leku uzupełnionym barwnikiem FM (ryc. 2b)^3,8.
3. Opcjonalnie - Alternatywnie, jeśli wpływ leku na egzocytozę jest interesujący, perfuzjuj neurony roztworem leku zarówno przed, jak i podczas bodźców rozładowujących RRP i RP (ryc. 2c)³.

7. Analiza danych

1. Do analizy danych używaj ImageJ i Microsoft Excel lub podobnego oprogramowania.
2. Do analizy wymagana jest sekwencja obrazów w formacie stosu. Niektóre programy do przetwarzania obrazu mogą eksportować sekwencje jako pojedyncze obrazy. W takim przypadku przekonwertuj obrazy na stos za pomocą wbudowanej funkcji ImageJ Image>Stacks>Images to stack
.
3. Dostosuj jasność i kontrast stosu, aby zmaksymalizować zakres dynamiki. Image>Adjust>Brightness/Contrast (Rysunek 3a).
4. Jeśli podczas eksperymentu wystąpił znaczny dryf poziomy, uruchom wtyczki StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) i TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/) na ImageJ, aby wyrównać stos obrazów (Rysunek 3b).
5. Uruchom wtyczkę analizatora szeregów czasowych (http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html) (Rysunek 3c).
6. Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) na co najmniej 90 zakończeniach nerwowych. Powinny one być identyczne (okrągłe ROI o średnicy 1,5 μm) Pomocne jest przełączanie się między obrazami przed i po odciążeniu barwnika, aby odsłonić aktywne zakończenia nerwowe (alternatywnie obraz przed stymulacją można odjąć od obrazu po stymulacji). Idealny rozmiar ROI to taki, który jest nieco większy niż typowe zakończenie nerwowe (ryc. 3c).
7. Uzyskaj całkowitą/zintegrowaną intensywność fluorescencji każdego zwrotu z inwestycji w czasie i wyeksportuj do programu Microsoft Excel (Rysunek 3d i 4a).
8. Znormalizuj ślady ROI do tej samej dowolnej wartości, wyrównując ścieżki w płaszczyźnie osi Y dla pierwszego bodźca rozładowującego w obu fazach S1 i S2 (rysunek 4b-c). Ma to na celu kontrolowanie niewielkich zmian intensywności fluorescencji tła.
9. Zmierz bezwzględny spadek fluorescencji wywołany przez każdy bodziec rozładowujący w dowolnych jednostkach fluorescencji dla S1 i S2 w następujący sposób (rysunek 4d):
   • RRP = zmiana fluorescencji (ΔF) wywołana przez 30 Hz 2 s
   • RP = suma ΔF wyzwalana przez 3 x 40 Hz 10 s
   • Całkowita pula recyklingu = RRP + RP
10. Dla każdego odpowiedniego parametru w ppkt 7.9 należy obliczyć średnią wartość dla wszystkich zakończeń nerwowych w pojedynczym doświadczeniu.
11. Do celów analizy statystycznej można uśrednić średnie wartości uzyskane z wielu niezależnych eksperymentów. Jako statystyczną wartość n należy stosować liczbę szkiełek nakrywkowych, a nie liczbę zakończeń nerwowych.

8. Reprezentatywne wyniki:

Eksperyment kontrolny, w którym CGN-y przeszły dwie rundy identycznych kroków załadunku i rozładunku, jest przedstawiony na rysunku 5. Rozpoczynając serię eksperymentów, ważne jest, aby eksperyment kontrolny, taki jak ten, był wykonywany każdego dnia w celu potwierdzenia, że S1 i S2 są porównywalne przed zmianą warunków eksperymentalnych podczas S2.

W tym przykładzie CGN-y zostały załadowane 10 μM FM1-43 przy użyciu stymulacji 80 Hz 10 s (Rysunek 5a). Rysunek 5b przedstawia zakończenia nerwowe obciążone FM1-43 reprezentowane przez fluorescencyjną punktę. Wartości ROI zdefiniowano na 90 zakończeniach nerwowych, jak pokazano na rysunku 5c. Ten sam zestaw ROI został użyty zarówno dla S1, jak i S2. Podczas obu rozładowań RRP został najpierw rozładowany ze stymulacją 30 Hz (2 s), a następnie rozładowany RP z 3 sekwencyjnymi bodźcami 40 Hz (10 s) (rysunek 5a). Spadek fluorescencji podczas każdego bodźca można wyraźnie zaobserwować i określić ilościowo (ryc. 5d-e). Po zbadaniu krople fluorescencji odpowiadające RRP, RP i całkowitej puli recyklingu były porównywalne zarówno w S1, jak i S2. Ponadto 20% przetworzonych SV znajdowało się w RRP, podczas gdy 80% znajdowało się w RP zarówno w S1, jak i S2.

Rysunek 1 Schemat ideowy typowego eksperymentu FM. A) Endocytoza SV jest wyzwalana w obecności barwnika FM (reprezentowanego na zielono). Barwnik jest pobierany przez wgłębianie błony (pojedyncze SV lub endosomy masowe). B) Niezinternalizowany barwnik na błonie plazmatycznej jest wypłukiwany przez perfuzję. C) Po zastosowaniu bodźca rozładowującego, znakowane SV, które stały się dostępne do uwolnienia, łączą się z błoną plazmatyczną, powodując utratę fluorescencji. D) Zmiana fluorescencji (ΔF), która jest proporcjonalna do ilości uwolnionych znakowanych SV, może być następnie określona ilościowo.

Rysunek 2 Schematy ideowe możliwych protokołów eksperymentalnych. A) Schemat blokowy eksperymentu kontrolnego, w którym komórki poddawane są dwóm rundom ładowania i rozładowywania barwnika FM (S1 i S2). Komórki mogą być ładowane za pomocą szeregu różnych bodźców. Kroki rozładunku są identyczne pod tym względem, że RRP jest rozładowywany z częstotliwością 30 Hz przez 2 s, a następnie rozładowuje się RP przy użyciu 3 razy 40 Hz przez 10 s. Bodźce rozładowujące RRP i pulę rezerwową były oddzielone o 40 sekund, a wszystkie inne bodźce o 30 sekund. Komórki pozostawia się do odzyskania na 20 minut między S1 i S2. Przedstawiono również schematy blokowe możliwych modyfikacji w celu zbadania wpływu substancji na B) endocytozę lub C) egzocytozę. Odpowiedni badany lek może być perfundowany do komory we wskazanych okresach.

Rysunek 3 Zrzuty ekranu przedstawiające analizę danych na rysunku J. Zrzuty ekranu są wyświetlane dla A) regulacji jasności i kontrastu, B) wyrównania klatki, C) wyboru ROI oraz D) ekstrakcji wartości intensywności za pomocą obrazu J.

Rysunek 4 Zrzuty ekranu przedstawiające analizę danych w programie Microsoft Excel. Zrzuty ekranu są pokazane dla A) importu surowych danych z obrazu J (1^kolumna = numer klatki, pozostałe kolumny = dane z poszczególnych zakończeń nerwowych) B) korekty wartości podstawowych S1 (klatka 10) do dowolnej wartości (200) na początku pierwszego bodźca, C) korekty wartości podstawowych S2 w klatce 55 przy użyciu identycznego protokołu jak S1, oraz D) pomiar kropli fluorescencji za pomocą programu Microsoft Excel. Należy pamiętać, że uśredniony ślad pokazany w D służy do definiowania punktów czasowych przed i po każdym kropli. Wielkość spadków fluorescencji dla każdego zwrotu z inwestycji należy określić na podstawie wartości w arkuszu kalkulacyjnym pokazanym w C.

Rysunek 5 . Reprezentatywny eksperyment kontrolny. A) Schemat blokowy eksperymentu kontrolnego, w którym CGN załadowano 10 μM FM1-43 przy użyciu stymulacji 80 Hz (10 s). Fazy S1 i S2 są identyczne. Bodźce rozładowujące RRP i pulę rezerwową były oddalone od siebie o 40 sekund, a wszystkie inne bodźce o 30 sekund. B) Obraz przedstawiający zakończenia nerwowe obciążone FM1-43. C) Ten sam obraz co B przedstawiający 90 ponumerowanych ROI wybranych do analizy. D) Obrazy obszaru przedstawionego przez czerwoną ramkę w B w wybranych punktach czasowych. Podstawowy = przed stymulacją; 30 Hz = po 30 Hz 2 s stymulacji; 40 Hz ^1,2,3 = po każdych 40 Hz 10 s stymulacji. Obrazy te są przedstawione w pseudokolorze, aby zilustrować zmiany fluorescencji (pasek widma wyświetlany po prawej stronie). E) Średni ślad ±SEM uzyskany z 90 zakończeń nerwowych przedstawionych w C. Poszczególne bodźce są reprezentowane przez poziome paski. Podziałka = 10 μm.

Discussion

Barwniki FM są szeroko stosowane do badania funkcji zakończeń nerwowych w wielu preparatach neuronalnych. Zostały one wykorzystane głównie do monitorowania zakresu endocytozy SV, obrotu SV lub kinetyki egzocytozy⁶. Opisany protokół rozszerza te badania o zbadanie różnicowego rozładowywania określonych pul SV. Dostarcza to dodatkowych informacji na temat uzupełniania pul SV, a także zakresu ich mobilizacji.

Barwniki FM mogą być używane do oznaczania wielu rund recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych. Wykorzystaliśmy tę właściwość i zaprojektowaliśmy protokoły, w których obrót SV w każdym terminalu może być monitorowany dwukrotnie w tych samych zakończeniach nerwowych. Zapewnia to dokładną kontrolę wewnętrzną, która jest niezbędna ze względu na niejednorodny charakter recyklingu SV w równoległych zakończeniach nerwowych¹¹. Dzięki zastosowaniu fazy S1 jako kontroli wewnętrznej, można niezawodnie i bezpośrednio porównać uzupełnianie RRP, RP i całkowitej puli SV w obecności leków.

Oprócz dostarczania informacji o bezwzględnej wielkości puli recyklingu, RRP i RP w różnych warunkach stymulacji, protokół ten może również dostarczyć danych w następujących kwestiach: 1) podziału SV między RRP i RP w funkcji puli recyklingu dla S1 i S2, 2) względnej wielkości puli S2 (RRP i RP) w funkcji całkowitej puli recyklingu S1 oraz 3) względnej wielkości dowolnej zdefiniowanej puli SV w S2 jako funkcji tej samej puli w S1. Ten konkretny protokół nie dostarczy jednak informacji na temat kinetyki rozładunku, ponieważ czas akwizycji jest zbyt wolny (w przypadku pomiarów kinetycznych czasy akwizycji powinny być jak najszybsze, a rozładunek automatycznie zsynchronizowany z przechwytywaniem obrazu).

Nasze bodźce 30 Hz 2 s wywołują identyczny stopień rozładowania RRP jak hipertoniczna sacharoza⁸. Ponieważ wielkość RRP jest definiowana przez hipertoniczne rozładowanie sacharozy¹⁵, możemy stwierdzić, że protokół ten rozładowuje wszystkie RRP SV, zgodnie z badaniami na neuronach hipokampa¹⁶. Pula rezerwowa jest prawie całkowicie wyczerpana przez trzy ciągi po 400 bodźców (40 Hz 10 s każdy), ponieważ ta stymulacja uwalnia identyczną ilość barwnika do paradygmatu (2 bodźce o 50 mM KCl), który wyczerpuje 95% wszystkich SV znakowanych barwnikiem^8,17. Dokładna kwantyfikacja wielkości zarówno RRP, jak i puli rezerwowej zależy również od uzyskania informacji w liniowym zakresie dynamiki kamery CCD.

Ten prosty protokół można również dalej modyfikować. Siła bodźców obciążających może być również zmieniana, aby określić, w jaki sposób aktywność neuronalna i różne tryby endocytozy wpływają na uzupełnianie puli SV. Ponadto, w razie potrzeby, można również wykonać więcej niż dwa cykle załadunku i rozładunku. Protokół ten może być również stosowany w komórkach transfekowanych wektorami nadekspresji lub shRNA. Ze względu na niską skuteczność transfekcji pierwotnych kultur neuronalnych, ekspresja białek musi być znakowana białkami fluorescencyjnymi. Istotne jest, aby te fluorescencyjne znaczniki nie zakłócały sygnału barwnika FM (na przykład użyj cyjanu lub czerwonych białek). W tym przypadku zakończenia nerwowe z komórek transfekowanych i nietransfekowanych w tym samym polu widzenia mogą być również porównywane jako dodatkowa kontrola⁸. W takich eksperymentach porównanie zakresu obciążenia między obciążeniami S1 i S2 ma niewielką wartość, ponieważ zakłócenia występują podczas obu obciążeń. Podział barwnika między pulami SV można jednak nadal wizualizować⁸.

Reportery genetyczne zwane pHluorin mogą być również stosowane do monitorowania egzocytozy SV i endocytozy w pierwotnej hodowli neuronalnej. Sondy te wykorzystują wrażliwe na pH zielone białko fluorescencyjne do środowiska pH domen luminalnych znakowanych białek SV, takich jak VAMP, synaptofizyna i VGLUT1¹⁸. W połączeniu z pęcherzykowymi inhibitorami ATPazy, pHluorins mogą zgłaszać zarówno kinetykę, jak i zakres mobilizacji puli SV¹⁹. Opisane tutaj podejście oparte na barwniku FM ma pewne zalety w porównaniu z techniką pHluorin, Po pierwsze, barwniki FM dostarczają informacji o tym, który tryb endocytozy SV uzupełnia pule RRP i rezerwowe⁸. Po drugie, określone pule SV mogą być oznaczone barwnikami FM, które mają różne właściwości spektralne²⁰ i ostatecznie nie ma wymogu transfekcji. Barwniki FM nie mogą jednak dostarczyć informacji o ruchu SV między pulami spoczynkowych i recyklingowych SV (w przeciwieństwie do pHluorins¹⁹), ponieważ z definicji SV muszą być naładowane barwnikiem podczas endocytozy, aby były widoczne. Tak więc zarówno barwniki FM, jak i pHluorin mają mocne i słabe strony i są najsilniejsze, gdy są wykorzystywane w niezależnych eksperymentach w celu rozwiązania tego samego pytania.

Wysokiej jakości obrazy są niezbędne do prawidłowej analizy i powtarzalnych wyników. Podczas gdy dryft poziomy można łatwo skorygować, eksperymenty, w których występuje dryft w osi Z, nie mogą być odzyskane. Z tego powodu ważne jest, aby ponownie ustawić ostrość obrazów przed rozpoczęciem rozładowywania S1 i S2. W przypadkach, gdy nastąpił znaczny rozpad fluorescencyjny, można zastosować poprawki zaniku (zwykle poprzez odjęcie wcześniej zarejestrowanego śladu od komórek obciążonych FM przy braku stymulacji). Sugeruje się jednak, że korekcja zaniku jest wykonywana tylko w celu przedstawienia graficznego i nie powinna być wykorzystywana do jakiejkolwiek analizy ilościowej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AxioCam MRm Rev. 3 Aparat cyfrowy	Carl Zeiss, Inc.
Mikroskop Axio Observer.A1	Carl Zeiss, Inc.
Płytki do hodowli komórkowych (6 dołków)	Wirówka Greiner Bio-One	657160
(uniwersalna 32R)	Inkubator Hettich Zentrifugen	1610
CO2	Heraeus Instruments	51014042
probówki Falcon (15/50 ml)	Greiner Bio-One	188271/210261
Fluar 20X /0,75 ∞/ 0.17 Cel	Carl Zeiss, Inc.
Szkiełka nakrywkowe szklane (25mm)	VWR international	631-1584
Szklane pipety Pasteura (230 nm)	Greiner Bio-One	612-1799
Hemocytometr	VWR international	15170-170
Komora obrazowania	Warner Instruments	RC-21 BRFS
Okap z przepływem laminarnym	BIOHIT	VLF BHS 1200
McIlwain Tissue Chopper	Mickle Laboratory Engineering Co., Ltd.	MTC/2
	Carl Zeiss, Inc.	HBO 103
Stymulator elektryczny systemu MultiStim (100mV, szerokość plus 1ms)	Digitimer Sp. z o.o.	D330
Pompa perfuzyjna	Pompy Watson-Marlow Grupa	313S
Pipety serologiczne (5/10/25 ml)	Greiner Bio-One	606180/607180/760180
Kontroler migawki	Carl Zeiss, Inc.
Strzykawka (20 ml)	BD Biosciences	ST01-B002
Filtry strzykawkowe (Minisart -– 0,20 μ m)	Sartorius AG	16532
VC-6 Sześciokanałowy sterownik zaworów	Warner Instruments	64-0135
Zestaw filtrów YFP (zestaw 46)	Carl Zeiss, Inc.	1196-681
Tabela 1. Specjalistyczny sprzęt i aparatura
FM1-43	Cambridge BioScience	BT70021	10 μ M
FM2-10	Cambridge BioScience	BT70044	100 μ M
Poli-D-lizyna	Sigma-Aldrich	P7886	15 μ g/ml
Smar silikonowy	Sigma-Aldrich	85403	-
Tabela 2. Stosowane odczynniki
Surowica bydlęca Albumina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503	0,3%
D-Glukoza	Sigma-Aldrich	G5767	0,25%
MgSO4· 7H2O	Sigma-Aldrich	M2773	1,5 mM
D-PBS	GIBCO, firmy Life Technologies	21300	960 mg/100 ml
-przygotuj 100ml świeżego dla każdego preparatu -sterylny filtr przed użyciem
Tabela 3. Roztwór B do przygotowania CGN
Roztwór B			19 ml
trypsyny (5 mg/ml bulionu, -20° C)	Sigma-Aldrich	T9201	1 ml
Tabela 4. Roztwór T do przygotowania CGN
Roztwór C			3,2 ml
Roztwór B			16,8 ml
Tabela 5. Roztwór W do przygotowania CGN
Deoksyrybonukleaza (DNaza, 500 j.m. na 0,5 ml bulionu, -20° C)	Sigma-Aldrich	D5025	0,5 ml
MgSO4· 7H2O	Sigma-Aldrich	M2773	1,5 mM
roztwór B			10 ml
inhibitora trypsyny sojowej (SBTI, 0,5 mg na 0,5 ml bulionu, -20° C)	Sigma-Aldrich	T9003	0,5 ml
Tabela 6. Roztwór C do przygotowania CGN
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503	4%
Earle' s Zrównoważony roztwór soli (EBSS)	GIBCO, firmy Life Technologies	24010	10 ml
MgSO4· 7H2O	Sigma-Aldrich	M2773	3 mM
Tabela 7. EBSS Roztwór do przygotowania CGN
Cytozyna β-D-arabinofuranozyd (Ara-C) *	Sigma-Aldrich	C1768	10 μ M
F– tal Surowica bydlęca	GIBCO, firmy Life Technologies	10106	10 %
D-Glukoza	Sigma-Aldrich	G5767	30 mM
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	2 mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	25 mM
Minimal Essential Medium (MEM)	GIBCO, firmy Life Technologies	21090	500 ml
Penicylina (P)/Streptomycyna (S)	GIBCO, firmy Life Technologies	15140	100 U/ml (P), 100 μ g/ml (S)
*Ara-C należy dodawać do podłoża począwszy od 1 DIV
Tabela 8. Pożywki hodowlane do przygotowania CGN
AxioVision Rel.	Carl Zeiss, Inc.	4.8
ImageJ	National Institutes of Health	1.42q
Microsoft Excel	Microsoft	2003
Tabela 9. Używane oprogramowanie komputerowe
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C7902	1,3 mM
Glukoza	Sigma-Aldrich	G5767	5 mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	3,5 mM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	0,4 mM
MgCl2· 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250	1,2 mM
NaCl	Fluka	71378	170 mM
NaHCO3	Fluka	71627	5 mM
Na2SO4	VWR	10264	1,2 mM
TES	Sigma-Aldrich	T1375	20 mM
Tabela 10. Roztwór soli fizjologicznej (pH 7,4)