Opisano technikę obrazowania fluorescencyjnego na żywo, służącą do ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Monitorowane są dwie rundy recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia kontrolę wewnętrzną.
Artykuł metodologiczny
Ilościowa analiza uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowlanych neuronach ziarnistych móżdżku z wykorzystaniem barwników FM
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Po uwolnieniu neuroprzekaźnika w centralnych zakończeniach nerwowych, pęcherzyki synaptyczne (SV) są szybko odzyskiwane w procesie endocytozy. Odzyskane SV są następnie ponownie napełniane neuroprzekaźnikiem i dołączają do puli recyklingowej, definiowanej jako pęcherzyki SV dostępne do egzocytozy1,2. Pulę recyklingową można zazwyczaj podzielić na dwie odrębne grupy – pulę łatwo uwalnianą (RRP) oraz pulę rezerwową (RP). Jak sugerują ich nazwy, RRP składa się z pęcherzyków SV natychmiast dostępnych do fuzji, podczas gdy pęcherzyki RP są uwalniane jedynie podczas intensywnej stymulacji1,2. Istotne jest posiadanie niezawodnego testu, który raportuje różnicowe uzupełnianie tych pul SV, aby zrozumieć 1) w jaki sposób pęcherzyki SV przemieszczają się po różnych trybach endocytozy (takich jak endocytoza zależna od klatryny i zależna od aktywności endocytoza masowa) oraz 2) mechanizmy kontrolujące mobilizację zarówno RRP, jak i RP w odpowiedzi na różne bodźce.
Barwniki FM są rutynowo stosowane do ilościowego określania obrotu pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych3-8. Posiadają one hydrofobowy ogon węglowodorowy, który umożliwia odwracalny podział w dwuwarstwie lipidowej, oraz hydrofilową grupę głowową, która blokuje przenikanie przez błony. Barwniki wykazują niską fluorescencję w roztworze wodnym, jednak ich wydajność kwantowa gwałtownie wzrasta po wbudowaniu się w błonę9. W związku z tym barwniki FM są idealnymi sondami fluorescencyjnymi do śledzenia aktywnie recyrkulujących SV. Standardowy protokół użycia barwnika FM jest następujący. Najpierw są one aplikowane do neuronów i pobierane podczas endocytozy (Rycina 1). Po wypłukaniu niezinternalizowanego barwnika z błony plazmatycznej, recyrkulujące SV ulegają redystrybucji w obrębie puli recyklingowej. Następnie pęcherzyki te są usuwane za pomocą bodźców wyzwalających uwalnianie (Rycina 1). Ponieważ znakowanie SV barwnikiem FM ma charakter kwantowy10, wynikający z tego spadek fluorescencji jest proporcjonalny do ilości uwolnionych pęcherzyków. Dzięki temu można wiarygodnie ilościowo określić recykling i fuzję SV powstałych w poprzedniej rundzie endocytozy.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół, który został zmodyfikowany w celu uzyskania dwóch dodatkowych elementów informacji. Po pierwsze, zastosowano sekwencyjne bodźce odciążające w celu różnicowego odciążenia RRP i RP, co umożliwia ilościowe określenie uzupełniania specyficznych pul SV. Po drugie, każde zakończenie nerwowe zostaje poddane protokołowi dwukrotnie. Dzięki temu odpowiedź tego samego zakończenia nerwowego w fazie S1 może zostać porównana z obecnością substancji testowej w fazie S2 (Rycina 2), co stanowi kontrolę wewnętrzną. Jest to istotne, ponieważ stopień recyklingu SV w różnych zakończeniach nerwowych jest wysoce zmienny11.
W ramach niniejszego protokołu można wykorzystać dowolne adhezyjne pierwotne hodowle neuronów, jednak gęstość wysiewu, roztwory oraz warunki stymulacji zostały zoptymalizowane dla neuronów ziarnistych móżdżku (CGNs)12,13.
Protokół
1. Przygotowanie neuronów ziarnistych móżdżku
- Zautoklawować około 10 szkiełek nakrywek o średnicy 25 mm (Tabela 1).
- Umieścić szkiełka nakrywki w sterylnej probówce o pojemności 50 ml zawierającej sterylną roztwór poli-D-lizyny (Tabela 2). Umieścić na platformie rotacyjnej na 2 h w celu powleczenia szkiełek.
- Osuszyć powlekone szkiełka nakrywki na sterylnej chusteczce higienicznej w komorze z laminarnym przepływem powietrza (Tabela 1).
- Umieścić szkiełka nakrywki w sterylnych płytkach 6-dołkowych i ogrzać w inkubatorze CO2 (Tabela 1). Szkiełka nakrywki można przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4°C przed użyciem.
- Eutanazować 7-dniowe szczurzę rasy Sprague Dawley zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji etycznej. Eutanazję przeprowadzono poprzez zwichnięcie karku.
- Wypreparować móżdżek i umieścić go w sterylnym naczyniu Petri zawierającym roztwór soli buforowanych fosforanowo (roztwór B, Tabela 3).
- Powtórzyć kroki 1.5 i 1.6 dla 4–6 szczurząt.
- Móżdżek następnie umieszcza się na sterylnym stoliku urządzenia McIlwain Tissue Chopper (Tabela 1). Tkanka jest cięta w odstępach 375 μm, po czym stolik obraca się o 90° i powtarza proces.
- Pokrojone móżdżki przenosi się do roztworu trypsyny (roztwór T, Tabela 4), który został wcześniej ogrzany do 37 °C.
- Inkubować móżdżki w temperaturze 37 °C przez 20 min z delikatnym mieszaniem mniej więcej co 5 min.
- Podczas trawienia trypsyną wypolerować ogniem trzy sterylne pipety szklane (Tabela 1) przy użyciu palnika Bunsena. Wykorzystać płomień do stworzenia wąskiego, średniego i szerokiego otworu w odpowiednio końcach pipet.
- Po 20 min inkubacji w roztworze T dodać 20 ml roztworu trypsyny i inhibitora DNazy (roztwór W, Tabela 5) do zawiesiny móżdżkowej i odwiradować komórki przy 1 0 g przez 1 min w wirówce stołowej (Tabela 1).
- Odlać nadnadfiltr i resuspendować osad komórkowy w 1,5 ml stężonego inhibitora trypsyny/DNazy (roztwór C, Tabela 6) za pomocą pipety o najszerszym otworze.
- Triturować komórki, używając najpierw pipety o szerokim otworze, następnie o średnim i na koniec o wąskim otworze, aż zawiesina komórkowa stanie się homogenna. Jest to kluczowy etap; zawiesina musi być na tym etapie homogenna.
- Nanieść zawiesinę komórkową warstwowo na 10 ml podgrzanego (37°C) roztworu Earles Balanced Salts Solution uzupełnionego o albuminę surowicy bydlęcej (Tabela 7) w sterylnej probówce 15 ml.
- Wirować zawiesinę przez 5 min przy 1 50g i resuspendować osad komórkowy w 2 ml podgrzanej (37°C) pożywki hodowlanej (Tabela 8).
- Oszacować liczbę komórek za pomocą hemocytometru (Tabela 1) i rozcieńczyć zawiesinę komórkową do końcowej gęstości 3,3 x 106 komórek na ml.
- Komórki wysiewać, dodając 75 μl zawiesiny komórkowej do środka szkiełek nakrywek powlekłych poli-D-lizyną (gęstość końcowa 2,5 x 105).
- Płytki hodowlane zawierające szkiełka nakrywki umieszcza się w inkubatorze CO2 na 60 min, aby umożliwić adhezję komórek.
- Dodać 1,5 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka, uważając, aby nie zaburzyć wysianych komórek, i zwrócić płytki hodowlane do inkubatora CO2.
- Następnego dnia wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę uzupełnioną o inhibitor mitotyczny cytyzynę arabinozydową (Tabela 8). Zatrzymuje to proliferację komórek glejowych w hodowli.
2. Układ eksperymentalny
- Podstawowa konfiguracja eksperymentalna powinna składać się z następujących elementów (szczegółowy wykaz sprzętu i oprogramowania znajduje się w Tabelach 1 i 9):
- Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny
- Chłodzona kamera CCD
- Fluorescencyjne źródło światła (monochromator lub koło filtrowe)
- Aparat do perfuzji grawitacyjnej
- Komora obrazowania z równoległymi elektrodami platynowymi
- Stymulator elektryczny
- Komputer
- Oprogramowanie do akwizycji obrazu
- Eksperymenty należy przeprowadzać w ciemności lub w warunkach czerwonego światła, przy minimalnym oświetleniu fluorescencyjnym próbki, aby uniknąć blaknięcia barwnika FM.
- Doświadczenia są przeprowadzane w temperaturze pokojowej. W przypadku konieczności zachowania temperatury fizjologicznej można zastosować system perfuzyjny z kontrolą temperatury.
3. Przygotowanie próbek
- Hodowle należy wykorzystać po 8–12 dniach in vitro.
- Przenieś pojedyncze szkiełko nakrywowe do roztworu soli fizjologicznej (Tabela 10) na 10 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić stabilizację w nowym medium.
- Wyjmij szkiełko nakrywowe, a następnie osusz jego dolną stronę oraz obszar wokół przytwierdzonych komórek za pomocą niewielkiego kawałka ręcznika papierowego lub papieru chłonnego.
- Używając smaru silikonowego (Tabela 2), przyklej szkiełko nakrywowe do spodu komory obrazowania. Komórki powinny znajdować się pomiędzy dwoma równoległymi drutami. Należy użyć odpowiedniej ilości smaru silikonowego, aby całkowicie uszczelnić komorę, dbając jednocześnie o to, by smar nie dostał się do środka komory kąpielowej.
- Ostrożnie wypełnij komorę kąpielową ok. 260 μl roztworu soli fizjologicznej, a następnie wypełnij rurkę doprowadzającą tym samym roztworem.
- Przyklej czyste szkiełko nakrywowe do górnej części komory za pomocą smaru silikonowego, aby ją uszczelnić. Rurki doprowadzająca i odprowadzająca mogą posłużyć do usunięcia pęcherzyków powietrza uwięzionych w komorze. Ważne jest, aby obwód elektryczny nie został przerwany przez pęcherzyki powietrza.
- Ustabilizuj komorę obrazowania w platformie ze stali nierdzewnej i sprawdź szczelność, delikatnie przepuszczając roztwór soli fizjologicznej przez rurkę doprowadzającą.
- Zamocuj zmontowaną komorę na stoliku mikroskopu odwróconego i podłącz ją do systemu perfuzji grawitacyjnej, uprzednio przepłukując wlot roztworem soli fizjologicznej.
- Podłącz przewody łączące komory do stymulatora elektrycznego.
- Nanieś kroplę olejku immersyjnego na obiektyw, jeśli używany jest obiektyw olejowy. Ustaw ostrość na komórkach w środku komory, korzystając z oświetlenia w polu jasnym.
4. Faza S1
- Przepłucz neurony 1,5 ml barwnika FM (Tabela 2) rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej.
- Stymuluj neurony, aby wywołać pobieranie barwnika, używając dołączonego stymulatora.
- Po stymulacji przepłucz neurony świeżym roztworem soli fizjologicznej przez 2 min, aby usunąć nadmiar barwnika FM (przepływ 7 ml / min). Zanieczyszczenie glejowe w systemie hodowli CGN wynosi mniej niż 5%14, zatem ten czas jest wystarczający do usunięcia barwnika.
- Pozostaw neurony do odpoczynku na 8 min.
- W tym odstępie czasu zlokalizuj sieci aksonalne, w których widoczne są poszczególne zakończenia nerwowe wypełnione barwnikiem FM, korzystając z długości fal fluoresceiny (podbudzenie 480 nm; emisja > 50 nm). Unikaj obszarów z skupiskami komórek. Na tym etapie ogranicz oświetlenie do minimum, ponieważ intensywna ekscytacja może prowadzić do fototoksyczności barwnika. Wyraźnymi objawami tego zjawiska są pęcherzykowanie aksonów oraz brak uwalniania barwnika (na skutek utrwalenia barwnika).
- Ponownie ustaw ostrość obrazu bezpośrednio przed akwizycją, ponieważ w okresie odpoczynku mógł wystąpić niewielki dryft.
- Rozpocznij akwizycję obrazów time-lapse z częstotliwością 1 klatki co 4 s.
- Po zarejestrowaniu 5 – 10 obrazów bazowych wywołaj egzocytozę RRP, podając stymulację 30 Hz przez 2 s (60 potencjałów czynnościowych)8. Rozpocznij stymulację ręcznie natychmiast po uchwyceniu klatki.
- Po zarejestrowaniu kolejnych 10 obrazów wywołaj egzocytozę SV z RP, stosując trzy stymulacje 40 Hz przez 10 s (40 potencjałów czynnościowych), w odstępach 30 s między nimi8.
- Zarejestruj kolejne 5 – 10 obrazów, a następnie wstrzymaj akwizycję obrazu.
5. Faza regeneracji (patrz Rysunek 2)
- Pozostawić neurony do regeneracji przez co najmniej 20 min.
- Opcjonalnie - Jeśli badany jest wpływ leku na endocytozę, w tym czasie należy perfundować neurony roztworem leku (Rycina 2b) 3,8.
6. Faza S2
- Powtórz protokół fazy S1 (sekcja 4) dla eksperymentu kontrolnego, korzystając z tego samego pola widzenia co w fazie S1.
- Opcjonalnie – jeśli należy zbadać wpływ leku na endocytozę, przeperfunduj neurony roztworem leku uzupełnionym o barwnik FM (Rycina 2b)3,8.
- Opcjonalnie – alternatywnie, jeśli przedmiotem zainteresowania jest wpływ leku na egzocytozę, przeperfunduj neurony roztworem leku zarówno przed, jak i w trakcie stymulacji rozładowującej RRP i RP (Rycina 2c)3.
7. Analiza danych
- Do analizy danych należy użyć programu ImageJ i Microsoft Excel lub podobnego oprogramowania.
- Do analizy wymagana jest sekwencja obrazów w formacie stosu (stack). Niektóre oprogramowanie do obrazowania może eksportować sekwencje jako pojedyncze obrazy. W takim przypadku należy przekonwertować obrazy na stos za pomocą wbudowanej funkcji ImageJ Image>Stacks>Images to stack.
- Należy dostosować jasność i kontrast stosu, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny. Image>Adjust>Brightness/Contrast (Rysunek 3a).
- Jeśli podczas eksperymentu wystąpił znaczący dryft poziomy, należy uruchomić wtyczki StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) oraz TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/) w programie ImageJ, aby wyrównać stos obrazów (Rysunek 3b).
- Należy uruchomić wtyczkę Time Series Analyzer (http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html) (Rysunek 3c).
- Należy zdefiniować obszary zainteresowania (ROI) dla co najmniej 90 zakończeń nerwowych. Powinny być one identyczne (okrągłe ROI o średnicy 1,5 μm). Pomocne może być przełączanie się między obrazami przed i po uwolnieniu barwnika w celu zidentyfikowania aktywnych zakończeń nerwowych (alternatywnie można odjąć obraz przed stymulacją od obrazu po stymulacji). Idealny rozmiar ROI to taki, który jest nieco większy niż typowe zakończenie nerwowe (Rysunek 3c).
- Należy uzyskać całkowitą/zintegrowaną intensywność fluorescencji każdego ROI w czasie i wyeksportować dane do programu Microsoft Excel (Rysunek 3d i 4a).
- Należy znormalizować ślady ROI do tej samej wartości arbitralnej poprzez wyrównanie śladów w płaszczyźnie osi Y dla pierwszego bodźca uwalniającego w obu fazach S1 i S2 (Rysunek 4b-c). Służy to skontrolowaniu niewielkich wariacji w intensywności fluorescencji tła.
- Należy zmierzyć absolutny spadek fluorescencji wywołany przez każdy bodziec uwalniający w arbitralnych jednostkach fluorescencji dla S1 i S2 w następujący sposób (Rysunek 4d):
- RRP = Zmiana fluorescencji (ΔF) wywołana przez 30 Hz 2 s
- RP = Suma ΔF wywołana przez 3 x 40 Hz 10 s
- Całkowita pula recyklingowa = RRP + RP
- Dla każdego istotnego parametru z punktu 7.9 należy obliczyć wartość średnią dla wszystkich zakończeń nerwowych w ramach jednego eksperymentu.
- Do analizy statystycznej można uśrednić wartości średnie uzyskane z wielu niezależnych eksperymentów. Jako statystyczne n należy przyjąć liczbę szkiełek podstawnych, a nie liczbę zakończeń nerwowych.
8. Reprezentatywne wyniki:
Eksperyment kontrolny, w którym CGN poddano dwóm identycznym cyklom obciążania i odciążania, przedstawiono na Rysunku 5. Przy rozpoczynaniu serii doświadczeń niezbędne jest przeprowadzanie każdego dnia takiego eksperymentu kontrolnego, aby potwierdzić, że S1 i S2 są porównywalne przed wprowadzeniem zmian w warunkach eksperymentalnych podczas S2.
W tym przykładzie CGN zostały załadowane 10 μM FM1-43 przy użyciu stymulacji 80 Hz przez 10 s (Rysunek 5a). Rysunek 5b przedstawia załadowane FM1-43 zakończenia nerwowe w postaci fluorescencyjnych punktów. Obszary zainteresowania (ROI) zdefiniowano dla 90 zakończeń nerwowych, jak pokazano na Rysunku 5c. Ten sam zestaw ROI zastosowano zarówno dla S1, jak i S2. Podczas obu procesów uwalniania barwnika, w pierwszej kolejności opróżniano RRP za pomocą stymulacji 30 Hz (2 s), a następnie opróżniano RP przy użyciu 3 sekwencyjnych bodźców 40Hz (10 s) (Rysunek 5a). Spadek fluorescencji podczas każdego bodźca można wyraźnie zaobserwować i ilościowo określić (Rysunek 5d-e). Po analizie stwierdzono, że spadki fluorescencji odpowiadające RRP, RP oraz całkowitej puli recyklingowej były porównywalne zarówno w S1, jak i S2. Ponadto w obu przypadkach, S1 i S2, 20% recyklingowanych SV znajdowało się w RRP, natomiast 80% znajdowało się w RP.
Rycina 1 Schemat typowego eksperymentu FMA) Endocytoza pęcherzyków synaptycznych (SV) zostaje zainicjowana w obecności barwnika FM (przedstawionego na zielono). Barwnik jest pobierany przez zagłębiającą się błonę (pojedyncze SV lub endosomy masowe). B) Niezinternalizowany barwnik na błonie komórkowej zostaje wypłukany poprzez perfuzję. C) Po zastosowaniu bodźca wyzwalającego uwalnianie, znakowane SV, które stały się dostępne do wydzielenia, łączą się z błoną komórkową, co skutkuje utratą fluorescencji. D) Zmianę fluorescencji (ΔF), która jest proporcjonalna do ilości uwolnionych znakowanych SV, można następnie ilościowo określić.
Rysunek 2 Schematy możliwych protokołów eksperymentalnychA) Schemat eksperymentu kontrolnego, w którym komórki poddano dwóm cyklom ładowania i uwalniania barwnika FM (S1 i S2). Ładowanie komórek może być indukowane różnymi bodźcami. Etapy uwalniania są identyczne: najpierw następuje uwalnianie z puli natychmiastowej (RRP) za pomocą stymulacji 30 Hz przez 2 s, a następnie uwalnianie z puli rezerwowej (RP) za pomocą 3 serii stymulacji 40 Hz po 10 s. Odstęp między bodźcami uwalniającymi RRP i pulę rezerwową wynosił 40 s, natomiast między wszystkimi pozostałymi bodźcami – 30 s. Między S1 a S2 komórki pozostawiono na 20 min w celu regeneracji. Przedstawiono również schematy możliwych modyfikacji w celu zbadania wpływu substancji na B) endocytozę lub C) egzocytozę. Odpowiedni lek testowy może być wprowadzany do komory w zaznaczonych okresach.
Rycina 3 Zrzuty ekranu z analizy danych w programie ImageJZrzuty ekranu przedstawiają: A) regulację jasności i kontrastu, B) wyrównywanie klatek, C) wybór obszarów ROI oraz D) ekstrakcję wartości natężenia przy użyciu programu Image J.
Rysunek 4 Zrzuty ekranu z analizy danych w programie Microsoft ExcelPrzedstawiono zrzuty ekranu dla A) importu surowych danych z programu Image J (1st kolumna = numer klatki, pozostałe kolumny = dane z poszczególnych zakończeń nerwowych) B) dostosowanie wartości bazowych S1 (klatka 10) do dowolnej wartości (20) na początku pierwszego bodźca, C) dostosowanie wartości bazowych S2 w klatce 5 przy użyciu protokołu identycznego jak dla S1 oraz D) pomiar spadków fluorescencji przy użyciu programu Microsoft Excel. Należy zauważyć, że uśredniony przebieg pokazany w punkcie D służy do zdefiniowania punktów czasowych przed i po każdym spadku. Wielkość spadków fluorescencji dla każdego ROI powinna zostać określona na podstawie wartości w arkuszu kalkulacyjnym pokazanym w punkcie C.
Rycina 5 Reprezentatywny eksperyment kontrolny. A) Schemat blokowy eksperymentu kontrolnego, w którym CGN zostały załadowane z 10μM FM1-43 przy użyciu stymulacji 80 Hz (10 s). Fazy S1 i S2 są identyczne. Stymulacja rozładowująca RRP i pulę rezerwową była oddzielona odstępem 40 s, wszystkie pozostałe stymulacje odstępem 30 s. B) Obraz przedstawiający zakończenia nerwowe załadowane FM1-43. C) Ten sam obraz co w B, przedstawiający 90 ponumerowanych ROI wybranych do analizy. D) Obrazy obszaru zaznaczonego czerwonym prostokątem w B w wybranych punktach czasowych. Basal = przed stymulacją; 30 Hz = po stymulacji 30 Hz przez 2 s; 40 Hz 1,2,3 = po każdej stymulacji 40 Hz przez 10 s. Obrazy te przedstawiono w pseudokolorach, aby zobrazować zmiany fluorescencji (pasek widma widoczny po prawej stronie). E) Średni przebieg ±SEM uzyskany z 90 zakończeń nerwowych przedstawionych w C. Poszczególne stymulacje zaznaczono poziomymi paskami. Paski skali = 10 μm.
Dyskusja
Barwniki FM są szeroko stosowane do badania funkcji zakończeń nerwowych w wielu preparatach neuronalnych. Wykorzystuje się je głównie do monitorowania zakresu endocytozy pęcherzyków synaptycznych (SV), ich obrotu lub kinetyki egzocytozy6. Opisany protokół rozszerza te badania o analizę różnicowego uwalniania barwnika ze specyficznych pul SV. Pozwala to uzyskać dodatkowe informacje na temat uzupełniania pul SV oraz zakresu ich mobilizacji.
Barwniki FM mogą być wykorzystywane do znakowania wielu cykli recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w tych samych zakończeniach nerwowych. Wykorzystaliśmy tę właściwość i opracowaliśmy protokoły, w których obrót SV w każdym zakończeniu może być monitorowany dwukrotnie. Zapewnia to dokładną kontrolę wewnętrzną, która jest niezbędna ze względu na heterogeniczny charakter recyklingu SV w równoległych zakończeniach nerwowych11. Dzięki wykorzystaniu fazy S1 jako kontroli wewnętrznej, ponowne napełnianie RRP, RP oraz całkowitej puli SV w obecności leków może być niezawodnie i bezpośrednio porównywane.
Oprócz dostarczenia informacji o bezwzględnej wielkości pul recyklingu, RRP (pul gotowych do uwolnienia) oraz RP (pul rezerwy) w różnych warunkach stymulacji, protokół ten może dostarczyć również danych dotyczących następujących kwestii: 1) podziału pęcherzyków synaptycznych (SV) pomiędzy RRP i RP w funkcji puli recyklingu dla S1 i S2, 2) względnej wielkości pul S2 (RRP i RP) w funkcji całkowitej puli recyklingu S1 oraz 3) względnej wielkości dowolnej zdefiniowanej puli SV w S2 w funkcji tej samej puli w S1. Niniejszy protokół nie dostarczy jednak informacji na temat kinetyki uwalniania, ponieważ czas akwizycji jest zbyt długi (w przypadku pomiarów kinetycznych czas akwizycji powinien być jak najkrótszy, a uwalnianie automatycznie zsynchronizowane z przechwytywaniem obrazu).
Nasze bodźce o częstotliwości 30 Hz i czasie trwania 2 s wywołują taki sam stopień opróżniania RRP jak sacharoza hipertoniczna8. Ponieważ wielkość RRP jest definiowana przez opróżnianie sacharozą hipertoniczną15, można stwierdzić, że protokół ten opróżnia wszystkie pęcherzyki synaptyczne (SVs) z RRP, co jest zgodne z badaniami przeprowadzonymi na neuronach hipokampa16. Pula rezerwowa zostaje niemal całkowicie wyczerpana przez trzy serie po 400 bodźców (40 Hz, każda po 10 s), ponieważ stymulacja ta uwalnia taką samą ilość barwnika jak paradygmat (2 bodźce z 50 mM KCl), który wyczerpuje 95% wszystkich znakowanych barwnikiem SVs8,17. Dokładna kwantyfikacja wielkości zarówno RRP, jak i puli rezerwowej zależy również od pozyskania informacji w liniowym zakresie dynamicznym kamery CCD.
Ten prosty protokół można dodatkowo modyfikować. Można również zmieniać siłę bodźców obciążających, aby określić, w jaki sposób aktywność neuronalna i różne tryby endocytozy wpływają na uzupełnianie puli SV. Ponadto, w razie potrzeby, można przeprowadzić więcej niż dwa cykle obciążania i rozładowywania. Protokół ten można również stosować w komórkach transfektowanych wektorami do nadekspresji lub wektorami shRNA. Ze względu na niską wydajność transfekcji pierwotnych kultur neuronalnych, białka wykazujące ekspresję muszą być znakowane białkami fluorescencyjnymi. Niezbędne jest, aby znaczniki fluorescencyjne te nie zakłócały sygnału barwnika FM (należy stosować na przykład białka cyjanowe lub czerwone). W takim przypadku, w ramach dodatkowej kontroli, można porównać zakończenia nerwowe komórek transfektowanych i nietransfektowanych w tym samym polu widzenia8. W takich eksperymentach porównanie stopnia obciążenia pomiędzy obciążeniami S1 a S2 ma niewielką wartość, ponieważ zaburzenie występuje podczas obu obciążeń. Niemniej jednak wciąż można wizualizować podział barwnika pomiędzy pule SV8.
Do monitorowania egzocytozy i endocytozy pęcherzyków synaptycznych (SV) w pierwotnych kulturach neuronalnych można wykorzystać reportery genetyczne zwane pHluorinami. Sondy te wykorzystują pH-zależne zielone białko fluorescencyjne do badania środowiska pH domen luminalnych znakowanych białek SV, takich jak VAMP, synaptofizyna i VGLUT118. W połączeniu z inhibitorami ATP-azy pęcherzykowej pHluoriny mogą informować zarówno o kinetyce, jak i stopniu mobilizacji puli SV19. Opisane tutaj podejście oparte na barwnikach FM posiada pewne zalety w stosunku do techniki z użyciem pHluorinów. Po pierwsze, barwniki FM dostarczają informacji o tym, który tryb endocytozy SV uzupełnia pulę natychmiastowo uwalnianą (RRP) oraz pule rezerwową8. Po drugie, konkretne pule SV mogą być znakowane barwnikami FM o różnych właściwościach spektralnych20, a po trzecie, metoda ta nie wymaga transfekcji. Barwniki FM nie mogą jednak dostarczyć informacji o ruchu SV pomiędzy pulą spoczynkową a recyklingową (w przeciwieństwie do pHluorinów19), ponieważ z definicji pęcherzyki SV muszą zostać załadowane barwnikiem podczas endocytozy, aby były widoczne. Zatem zarówno barwniki FM, jak i pHluoriny mają swoje mocne i słabe strony i są najskuteczniejsze, gdy są wykorzystywane w niezależnych eksperymentach w celu odpowiedzi na to samo pytanie.
Obrazy wysokiej jakości są niezbędne dla prawidłowej analizy i powtarzalnych wyników. Podczas gdy dryft poziomy można łatwo skorygować, eksperymenty, w których wystąpił dryft w osi Z, nie mogą zostać odratowane. Z tego powodu ważne jest ponowne ustawienie ostrości obrazów przed rozpoczęciem rozładowania S1 i S2. W przypadkach, gdy nastąpił znaczny spadek fluorescencji, można zastosować korekcję zaniku (zazwyczaj poprzez odjęcie wcześniej zarejestrowanego śladu z komórek obciążonych FM w warunkach braku stymulacji). Sugeruje się jednak, aby korekcję zaniku wykonywać wyłącznie w celu prezentacji graficznej i nie stosować jej do żadnej analizy ilościowej.
Oświadczenia
Nie mamy żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantu Wellcome Trust (nr ref.: 084277).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cyfrowa kamera AxioCam MRm Rev. 3 | Carl Zeiss, Inc. | 4265099901000 | |
| Mikroskop Axio Observer.A1 | Carl Zeiss, Inc. | 4310040000000 | |
| Płytki do hodowli komórkowych (6 dołków) | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Wirówka (Universal 32R) | Wirówki Hettich | 1610 | |
| CO2 inkubator | Heraeus Instruments | 51014042 | |
| Probówki Falcon (15/50 ml) | Greiner Bio-One | 188271/210261 | |
| Fluar 20X /0,75 ∞/0.17 Cel | Carl Zeiss, Inc. | 4401459901000 | |
| Szkiełka nakrywkowe (25 mm) | VWR international | 631-1584 | |
| Szklane pipety Pasteura (230 nm) | Greiner Bio-One | 612-1799 | |
| Komora licznikowa (hemocytometr) | VWR international | 15170-170 | |
| Komora obrazowania | Warner Instruments | RC-21 BRFS | |
| Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza | BIOHIT | VLF BHS 120 | |
| Krojonka do tkanek McIlwaina | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 | |
| Lampa rtęciowa | Carl Zeiss, Inc. | HBO 103 | |
| Stymulator elektryczny systemu MultiStim (10 mV, szerokość impulsu 1 ms) |  Digitimer Ltd. | D30 | |
| Pompa perfuzyjna | Watson-Marlow Pumps Group | 313S | |
| Pipety serologiczne (5/10/25 ml) | Greiner Bio-One | 606180/607180/760180 | |
| Sterownik migawki | Carl Zeiss, Inc. | MAC500 | |
| Strzykawka (20 ml) | BD Biosciences | ST01-B02 | |
| Filtry strzykawkowe (Minisart -– 0.20 μm) | Sartorius AG | 16532 | |
| Kontroler zaworów sześciokanałowy VC-6 | Warner Instruments | 64-0135 | |
| Zestaw filtrów YFP (Zestaw 46) | Carl Zeiss, Inc. | 1196-681 | |
| Tabela 1. Wykorzystany specjalistyczny sprzęt i aparatura | |||
| FM1-43 | Cambridge BioScience | BT7021 | 10 μM |
| FM2-10 | Cambridge BioScience | BT704 | 100 μM |
| Poli-D-lizyna | Sigma-Aldrich | P786 | 15 μg/ml |
| Smar silikonowy | Sigma-Aldrich | 85403 | - |
| Tabela 2. Wykorzystane odczynniki specyficzne | |||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 0.3% |
| D-glukoza | Sigma-Aldrich | G5767 | 0.25% |
| MgSO₄4·7H2O | Sigma-Aldrich | M273 | 1,5 mM |
| D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300 | 960 mg/10 ml |
| -przygotować 10 ml świeżego roztworu dla każdego przygotowania -przefiltrować przez filtr sterylny przed użyciem | |||
| Tabela 3. Roztwór B do przygotowania CGN | |||
| Roztwór B | 19 ml | ||
| Trypsyna (stok 5 mg/ml, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9201 | 1 ml |
| Tabela 4. Roztwór T do przygotowania CGN | |||
| Roztwór C | 3,2 ml | ||
| Roztwór B | 16,8 ml | ||
| Tabela 5. Roztwór W do przygotowania CGN | |||
| Deoksyribonukleaza (DNaza, roztwór stokowy 50 J na 0,5 ml, -20°C) | Sigma-Aldrich | D5025 | 0,5 ml |
| MgSO₄4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M273 | 1,5 mM |
| Roztwór B | 10 ml | ||
| inhibitor trypsyny z soi (SBTI, stężenie zapasowe 0,5 mg na 0,5 ml, -20°C) | Sigma-Aldrich | T903 | 0,5 ml |
| Tabela 6. Roztwór C do przygotowania CGN | |||
| Albumin surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 4% |
| Earle’zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 24010 | 10 ml |
| MgSO₄4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M273 | 3 mM |
| Tabela 7. Roztwór EBSS do przygotowania CGN | |||
| Cytozyna β-D-arabinofuranozyd (Ara-C) * | Sigma-Aldrich | C1768 | 10 μM |
| F–surowica bydlęca | GIBCO, by Life Technologies | 10106 | 10 % |
| D-glukoza | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM |
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | G3126 | 2 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 25 mM |
| Minimalne Podłoże Niezbędne (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 21090 | 50 ml |
| Penicylina (P)/Streptomycyna (S) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | 10 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
| *Ara-C należy dodawać do pożywki od 1. dnia in vitro (DIV) | |||
| Tabela 8. Pożywki do przygotowania CGN | |||
| AxioVision Rel. | Carl Zeiss, Inc. | 4.8 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1,42q | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 2003 | |
| Tabela 9. Wykorzystane specjalistyczne oprogramowanie komputerowe | |||
| CaCl22 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 1,3 mM |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G5767 | 5 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3,5 mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 0,4 mM |
| MgCl₂2·6h2O | Sigma-Aldrich | M0250 | 1,2 mM |
| NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
| NaHCO₃3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
| Na2SO4 | VWR | 10264 | 1,2 mM |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | 20 mM |
| Tabela 10. Roztwór soli fizjologicznej (pH 7,4) |
Bibliografia
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle revisited. Neuron. 28, 317-320 (2000).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5. J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes. Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).
- Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).
- Clayton, E. L. The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles. J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).
- Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals. J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).
- Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover. Nature. 388, 478-482 (1997).
- Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses. Neuron. 18, 599-612 (1997).
- Tan, T. C. Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis. Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).
- Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons. Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).
- Gallo, V. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Stevens, C. F. Neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 40, 381-388 (2003).
- Mozhayeva, M. G. Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).
- Cousin, M. A., Evans, G. J. O. Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons. J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2. J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release. Neuron. 67, 797-809 (2010).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool. Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).
Przedruki i uprawnienia
