Barwienie fluorescencyjne komórek grzebienia nerwowego hodowanych na hydrożelach o różnej sztywności

Streszczenie

Źródło: Le, T. P., et al., Zoptymalizowany system O9-1/hydrożelowy do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie opisujemy procedurę barwienia fluorescencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej w celu zademonstrowania barwienia falloidyną komórek grzebienia nerwowego hodowanych na hydrożelach o różnej sztywności w celu wizualizacji i analizy organizacji cytoszkieletu.

Protokół

1. Molekularna analiza sztywności za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

1. Użyj pęsety, aby przetransportować szkiełko nakrywkowe na nową płytkę, aby zminimalizować fałszywe sygnały z komórek wyhodowanych bezpośrednio na płytce. Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl sterylnego PBS w celu usunięcia martwych komórek i pozostałej pożywki hodowlanej.
2. Utrwal komórki za pomocą niezakłóconych 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie umyj komórki trzy razy, używając 500 μl PBS/studzienkę przez 2 minuty każde.
   UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia procedury.
3. Potraktuj komórki 500 μl 0,1% Triton X-100 przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj komórki trzykrotnie 500 μl PBS/studzienkę.
4. Zablokuj komórki 250 μl 10% surowicy osła (rozcieńczonej w PBS i 0,1% Tween 20) na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Inkubować komórki z falloidyną używaną do barwienia F-aktyny w rozcieńczeniu 1:400 w 250 μl 10% surowicy osła przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS przez 5 minut każda.
   UWAGA: Falloidyna o długości fali 568 nm może być inkubowana z przeciwciałami drugorzędowymi o długości fali 488 nm lub 647 nm lub samodzielnie.
6. Inkubować komórki z 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, rozcieńczenie 1:1000) w 250 μl PBS przez 10 minut, a następnie ostatnie płukanie PBS przez 2 min.
7. Dodaj 3-4 krople podłoża montażowego do każdej studzienki. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny przed obrazowaniem, aby upewnić się, że podłoże mocujące zostało prawidłowo ustawione.
8. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego uchwyć obrazy co najmniej 3 losowych ramek na próbkę hydrożelu, tworząc pojedyncze i połączone kanały.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2 mm #1 Corning 0211 Szkiełko nakrywkowe	Chemglass Nauki przyrodnicze	CLS-1763-012
25 mm #1 Corning 0211 Szkiełko nakrywkowe	Chemglass Nauki Przyrodnicze	CLS-1763-025
4-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Thermo Scientific	179830
4% paraformaldehydu	Sigma Aldrich	J61899-AP
40% akryloamidu	Sigma Aldrich	A4058
Alexa Fluor 488 Falloidyna	Rybak termiczny	A12379
Kolagen typu I (100mg)	Corning	354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol, Dichlorowodorek)	Rybak termiczny	D1306
Surowica osła	Sigma Aldrich	D9663
Sterylne 1x PBS	Hyklon	SH30256.02
Mikroskop fluorescencyjny	Leica