$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie roztworów roboczych i buforów
UWAGA: Rano w dniu testu przygotuj następujące roztwory. Obliczenia te opierają się na niezbędnych rozwiązaniach do przetworzenia dwóch regionów mózgu (tj. kory przedczołowej [PFC] i hipokampa [HPC]) od 12 myszy.
- Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF, pH = 7,4), jak wspomniano w Tabela 1. Dozować 750 μl aCSF do każdej probówki do pobierania próbek i umieścić je w metalowym bloku temperatury na lodzie w celu wstępnego schłodzenia buforu.
- Przygotować bufor do lizy, jak wspomniano w Tabela 2. Przechowywać na lodzie (400 μl na próbkę).
- Przygotować 52 mM suberanu bis(sulfosukcynimidylu) lub roztwór podstawowy BS3 (26x) w 5 mM buforze cytrynianu sodu (pH = 5,0).
- Najpierw przygotuj 100 mM kwasu cytrynowego (zapas A) i 100 mM cytrynianu sodu (zapas B).
- Rozcieńczyć zapas A i zapas B w stosunku 1:20 wodą dejonizowaną. Dodaj po 100 μl do 1,9 ml wody, aby przygotować odpowiednio 5 mM kwasu cytrynowego (zapas C) i 5 mM cytrynianu sodu (zapas D).
- Zmieszać 410 μl roztworu C i 590 μl roztworu D, aby przygotować 5 mM bufor cytrynianu sodu (pH = 5,0) (roztwór E, 1 ml).
- Potwierdzić pH roztworu E za pomocą paska wskaźnika pH.
- Rozpuścić 24 mg BS3 w 806,4 μl roztworu E, wirując przez 30 sekund w celu przygotowania roztworu podstawowego BS3 (26x).
- Przygotować kolejny 1 ml roztworu E do użycia jako kontrola nośnika dla próbek niesieciujących.
UWAGA: Przygotuj roztwór podstawowy BS3, gdy wszystko inne jest gotowe, a eksperyment ma się rozpocząć. BS3 należy przechowywać w stanie wysuszonym w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Po rozpuszczeniu BS3 pozostaje aktywny tylko przez około ≤3 godziny. Ponieważ podaje się, że pH 5 mM buforu cytrynianu sodu (roztwór E) wzrasta z czasem, powodując przyspieszoną hydrolizę BS3, zaleca się, aby roztwór E był przygotowywany świeżo z roztworów podstawowych A i B. Ze względu na ograniczoną rozpuszczalność BS3 w niskich temperaturach, rozpuszczony BS3 należy przechowywać w temperaturze RT. Rozpuszczony BS3 należy zużyć w ciągu 3 godzin, i nie zamrażać/rozmrażać ani nie używać ponownie rozpuszczonego BS3.
2. Preparacja tkanek mózgowych
UWAGA: Od tego kroku co najmniej dwie osoby powinny współpracować ze sobą w skoordynowany sposób. Podczas gdy jedna osoba skupia się na sekcji zwierząt, druga osoba powinna pracować jako chronometrażysta i pomagać w koordynowaniu testu.
- Przynieś pierwsze zwierzę do sekcji z pomieszczenia do pomieszczenia do prosektorium.
UWAGA: Ponieważ ostre czynniki stresogenne (np. nowe środowisko, zapach krwi) mogą wpływać na dynamikę białek mózgowych, zwierzęta powinny być trzymane w swoich domowych klatkach umieszczonych z dala od obszaru sekcji, a następnie powinny być przenoszone pojedynczo do sali sekcyjnej w celu natychmiastowego ścięcia głowy.
- Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie dekapitację. Szybko wyjmij mózg z czaszki i zanurz go w lodowatym PBS na szalce Petriego na 10-15 s (Rysunek 1).
UWAGA: Zwierzęta nie są znieczulane do eksperymentów BS3, ponieważ każdy środek znieczulający może potencjalnie wpłynąć na poziom prezentacji receptorów neuroprzekaźników na powierzchni.
- Umieść schłodzony mózg w macierzy mózgowej na lodzie, brzuszną stroną mózgu skierowaną do góry (Rysunek 2).
- Włóż pierwszą żyletkę przez granicę między opuszką węchową a szypułką węchową, aby przeciąć mózg koronalnie (Rysunek 3). Używając trzech do czterech dodatkowych żyletek, seryjnie naciąć przednią część mózgu w odstępach 1 mm.
- Podnieś wycinki koronalne z macierzy mózgowej, trzymając wszystkie włożone żyletki razem, pozostawiając tylną część mózgu w tyle w macierzy mózgowej. Użyj kleszczy, aby oddzielić żyletki od siebie i umieść je na płaskiej, schłodzonej powierzchni plasterkiem mózgu skierowanym do góry (Rysunek 4).
- Zidentyfikuj wycinki zawierające obszar zainteresowania. W celu pobrania próbki PFC należy wybrać drugi i trzeci plasterek znajdujący się za pierwszym wycinkiem zawierającym szypułkę węchową.
- Usuń obszar zainteresowania za pomocą stempla do tkanek, odłóż go na schłodzoną żyletkę i równomiernie podziel tkankę na dwie części (np. Tkanki z lewej i prawej półkuli, przy czym jedna połowa ma być użyta do reakcji sieciowania BS3, a druga połowa do kontroli bez sieciowania, jeśli docelowe białko będące przedmiotem zainteresowania jest równomiernie wyrażane w obu półkulach).
- Zmiel każdą tkankę na kawałki na żyletce za pomocą cienkiej końcówki kleszczy z wieloma pionowymi ruchami na ostrzu, zamiast tłuc lub mielić tkanki. Pozwoli to zmaksymalizować powierzchnię dostępną dla BS3 bez poważnego naruszenia integralności błony komórkowej. Natychmiast po rozdrobnieniu należy przenieść rozdrobnione tkanki do odpowiednich probówek (patrz krok 3.3).
3. Reakcja sieciowania
- Przynieś następne zwierzę do sekcji z pomieszczenia do pomieszczenia prosektoryjnego, gdy sekcja mózgu poprzedniej myszy ma się zakończyć (krok 2.10).
- Do probówki wstępnie schłodzonej na lodzie należy dodać 30 μl roztworu BS3 (26x) lub roztworu nośnika E tuż przed tym, jak zmielone tkanki będą gotowe do przeniesienia do odpowiednich probówek. Zmień końcówki pipet między probówkami, aby upewnić się, że BS3 nie jest zanieczyszczony w rurkach kontrolnych bez sieciowania.
- Przenieś zmielone tkanki (z kroku 2.8) do odpowiednich probówek, a następnie rozpocznij sekcję następnego zwierzęcia (krok 2.2).
- Odwróć i wymieszaj probówkę, aby rozbić kawałki tkanki na mniejsze kawałki i rozpocznij inkubację próbek na rotatorze probówki w chłodni przez 30 minut do 2 godzin. Zapisz czas rozpoczęcia inkubacji BS3 dla każdej probówki. Zobacz sekcję dyskusji, aby uzyskać informacje na temat optymalnego czasu inkubacji.
- Stłumić reakcję, napełniając probówkę 78 μl 1 M glicyny, a następnie inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją. Zapisz czas rozpoczęcia i zakończenia hartowania dla każdej probówki. Kontynuuj asystowanie osobie skupiającej się na sekcji zwierzęcia, przynosząc następne zwierzę (krok 3.1) i pomagając w sieciowaniu (krok 3.2).
UWAGA: Traktuj każdą próbkę dokładnie w tym samym czasie na wszystkich próbkach. Jeśli pomieszczenie sekcyjne znajduje się daleko od pomieszczenia chłodniczego, zdecydowanie zaleca się zatrudnienie trzeciej osoby do udziału w inkubacji próbki i hartowaniu w chłodni.
Tabela 1: Skład sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego.
| Działająca konc. | Roztwór podstawowy | Ilość roztworu podstawowego do dozowania |
| 1.2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 m (34x) | 1176.5 μL |
| 2.7 mM KCl | 1,08 m (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM glukozy | 2,5 m (250x) | 160 μL |
| Woda dejonizowana | | 37.563 ml |
| Razem | | 40 ml |
| * Staw CaCl2 powinien być świeżo przygotowany w dniu eksperymentu. |
Tabela 2: Skład buforu do lizy
| Działająca konc. | Roztwór podstawowy | Ilość roztworu podstawowego do dozowania |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 m (10x) | 2 ml |
| 2 mM EDTA | 0,5 m (250x) | 80 μL |
| 1 mM DTT | 1 M (1000x) | 20 μL |
| 0,1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Koktajl inhibitorów proteazy | 100x | 200 μL |
| Woda dejonizowana | | 17 ml |
| Razem | | 20 ml |
