Ocena wychwytu glukozy w neuronach ruchowych larw Drosophila z podwyższonym metabolizmem glukozy

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Loganathan, S., i inni., Pomiar wychwytu glukozy w Drosophila Modele proteinopatii TDP-43. J. Vis. Exp. (2021).

Film przedstawia technikę pomiaru wychwytu glukozy w larwalnych neuronach ruchowych {{}}Drosophila za pomocą wewnątrzkomórkowego czujnika glukozy opartego na rezonansie fluorescencyjnym (FRET). Po wypreparowaniu larw w celu odsłonięcia brzusznego rdzenia nerwowego, neurony ruchowe są wizualizowane za pomocą fluorescencji emitowanej przez fluorofor dawcy czujnika. Po stymulacji glukozą, FRET między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi czujnika wyzwala emisję fluorescencji z akceptora, umożliwiając porównanie wychwytu glukozy między larwami kontrolnymi a larwami zmutowanymi o zwiększonym metabolizmie glukozy.

Protokół

1. Drosophila Rozwarstwienie brzusznego rdzenia nerwowego (VNC)

Wykonaj naczynia do rozwarstwiania z elastomeru silikonowego.
1. Wlej składniki elastomeru silikonowego do probówki o pojemności 50 ml, jak wskazano w protokole producenta i dobrze wymieszaj.
2. Napełnić 35-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych około 2 ml mieszaniny elastomerów. Użyj strzykawki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Przykryj naczynia i umieść je na równej powierzchni w piekarniku o temperaturze 60 °C na noc, aby się utwardziły.
Wypreparuj larwy Drosophila, aby odsłonić VNC przy jednoczesnym zachowaniu żywotności tkanek.
1. Zebrać wędrującą larwę w trzecim stadium rozwojowym, spłukać ddH₂O, a następnie umieścić ją w kropli buforu podobnego do hemolimfy 3 (HL3) (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM sacharozy, 5 mM trehalozy, 5 mM kwasu hydroksyetylopiperazyno-etanosulfonowego [HEPES]; pH 7,1) na naczyniu wyłożonym elastomerem.
2. Używając pary kleszczy (#5 lub 55 kleszczy) pod mikroskopem preparacyjnym, przypnij przednie i tylne końce larwy grzbietową stroną do góry, ostrożnie rozciągając larwę wzdłuż za pomocą szpilek do owadów (Minutein Pins).
3. Wykonaj nacięcie tuż nad tylną szpilką za pomocą nożyczek do tęczówki pod kątem. Wykonaj pionowe cięcie, zaczynając od nacięcia w kierunku przedniego końca larwy.
4. W razie potrzeby dodaj kilka kropli buforu HL-3. Usuń tchawicę i resztę pływających narządów bez naruszania ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Przypnij płatki rozciągające ścianę ciała, aby odsłonić OUN, zachowując nienaruszony układ nerwowo-mięśniowy (VNC, aksony i połączenia nerwowo-mięśniowe).

2. Akwizycja obrazu

Zoptymalizuj parametry obrazowania.
1. Włącz mikroskop i lasery przed rozpoczęciem sekcji. Obrazy muszą być uzyskiwane przy użyciu pionowego mikroskopu konfokalnego z 40-krotnym obiektywem zanurzonym w wodzie. Użyj lasera 405 nm do wzbudzenia cyjanowego białka fluorescencyjnego (CFP) i uzyskaj obrazy zarówno w kanałach detekcji CFP (465-499 nm), jak i FRET (535-695 nm).
2. Zoptymalizuj parametry akwizycji, takie jak szybkość skanowania (6), średnia (2), obiektyw (40x), powiększenie (1x), rozmiar otworka (1 AU) i rozdzielczość przestrzenna (512 x 512). Dostosuj wzmocnienie tak, aby sygnał znajdował się w optymalnym zakresie dynamiki. Te same parametry muszą być stosowane dla wszystkich genotypów.
Obraz neuronów ruchowych w VNC.
1. Umieść silikonowe naczynie z wypreparowaną próbką pod soczewką. Opuść soczewkę tak, aby stykała się z buforem HL3 trehalozy i sacharozy. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że obiektyw jest całkowicie zanurzony w buforze. W razie potrzeby dodaj więcej bufora.
2. Użyj kanałów CFP i FRET, aby ręcznie wybrać sekcję optyczną, która składa się z co najmniej 6 neuronów ruchowych w ognisku, znajdujących się wzdłuż linii środkowej VNC. Neurony ruchowe są identyfikowane na podstawie ekspresji czujnika glukozy i położenia wzdłuż osi przednio-tylnej.
3. Rejestruj obrazy co 10 s przez 10 minut. Te obrazy reprezentują linię bazową.
Stymuluj HL-3 z dodatkiem glukozy.
1. Usunąć bufor HL3 zawierający trehalozę-sacharozę za pomocą pipety Pasteura i zastąpić go 5 mM uzupełnionym glukozą HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM sacharozy, 5 mM glukozy, 5 mM HEPES, pH 7,1). Ten krok należy wykonać z dużą ostrożnością, aby w jak największym stopniu uniknąć ruchu VNC.
2. Rób zdjęcia co 10 s przez kolejne 10 minut. Obrazy te reprezentują fazę stymulacji.
Zapisz obrazy jako pliki .czi lub dowolny typ pliku obsługiwany przez oprogramowanie do obrazowania z nazwą pliku zawierającą datę, tło genetyczne, warunki eksperymentalne (linia bazowa lub stymulacja) i używane kanały.
Ponownie wykorzystaj parametry do zobrazowania wszystkich genotypów (rysunek 1A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Analiza obrazu czujnika glukozy w kontekście mutacji TDP-43. (A) Reprezentatywne obrazy sygnałów FRET i CFP w kontrolach czujnika glukozy i próbkach TDP-43^G298S w warunkach wyjściowych i stymulacji. Reprezentatywny neuron ruchowy jest przedstawiony na każdym obrazie jako przykład zwrotu z inwestycji. Podziałka skali: 20 μm. Powiększenie: 40x. (B...