$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Barwienie immunologiczne
UWAGA: Wykonaj wszystkie mycia i inkubacje na wytrząsarce platformy orbitalnej ustawionej na około 100 obr./min. Wszystkie etapy przeprowadza się w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem inkubacji przeciwciał pierwotnych, która jest przeprowadzana w temperaturze 4 °C. Przygotować pożywkę montażową z wyprzedzeniem, łącząc składniki w probówce o pojemności 50 ml i mieszając na nutatorze przez noc. Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 miesięcy. Jeśli endogenny sygnał fluorescencyjny jest wystarczający do obrazowania i analizy bez konieczności barwienia immunologicznego, kroki 1.1-1.9 można pominąć. Jeśli pomijasz barwienie immunologiczne, wykonaj trzy 10-minutowe prania w TBS i przejdź do kroku 1.10.
- Przygotuj świeży roztwór TBST (0,2% Triton w TBS), dodając 1 ml 10% Triton-X do probówki o pojemności 50 ml i wypełniając probówkę do 50 ml 1x TBS. Przygotuj 2 ml roztworów blokujących i przeciwciał (10% koziej surowicy w TBST) dla każdego mózgu.
UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, przygotuj świeży TBST dla każdego nowego eksperymentu barwienia i użyj wysokiej jakości źródła 10% wodnego Triton-X (Tabela materiałów).
- Oznacz płytkę 24-dołkową zgodnie ze schematem (Rysunek 1). Umieść różne próbki w różnych rzędach i różne roztwory w różnych kolumnach. Dodać 1 ml TBST do pierwszych trzech kolumn ("Wash 1", "Wash 2" i "Wash 3"). Dodać 1 ml roztworu blokującego do czwartej kolumny.
- Przygotuj szklany szpikut, topiąc końcówkę pipety Pasteura 5,75 w małym haku za pomocą palnika Bunsena. Użyj tego kilofa, aby przenieść skrawki tkanki z płytki 12-dołkowej do kolumny Wash 1 płytki 24-dołkowej.
UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, przesiewaj sekcje przed rozpoczęciem barwienia. Aby przesiać skrawki, przenieś je pojedynczo na szalkę Petriego wypełnioną 1x TBS i zbadaj skrawki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 5x lub 10x, aby upewnić się, że obecna jest odpowiednia liczba komórek znakowanych fluorescencyjnie. Zaleca się barwienie od czterech do sześciu sekcji na studzienkę, chociaż w razie potrzeby można zabarwić do ośmiu na studzienkę.
- Myć sekcje przez 10 minut każda w przemyciu 1, 2 i 3 studzienek, a następnie inkubować je przez 1 godzinę w roztworze blokującym. Użyj szpikulca do szkła, aby przenieść sekcje z jednej studzienki do drugiej. Kilof może być używany do przenoszenia wielu sekcji mózgu jednocześnie.
- Przygotować 1 ml roztworu przeciwciał pierwszorzędowych dla każdej próbki (np. Rabbit RFP 1:2000 lub Chicken GFP 1:2000). Dodać przeciwciało do roztworu przeciwciała, krótko wirować, a następnie wirować przez 5 minut w temperaturze ≥ 4 000 x g w temperaturze 4 °C. Inkubować skrawki w przeciwciałie pierwszorzędowym przez dwie do trzech nocy w temperaturze 4 °C, wstrząsając.
- Po inkubacji przeciwciał pierwotnych odessać TBST dnia 1 ze studzienek płuczkowych, dodać 1 ml nowego TBST do każdego dołka do płukania i przenieść skrawki do pierwszego dołka płukania. Umyj sekcje 3x po 10 min każda.
UWAGA: Do aspiracji użyj 9-calowej pipety Pasteura połączonej rurką z kolbą próżniową. Jako źródło próżni można użyć domowych przewodów próżniowych lub elektrycznej pompy próżniowej.
- Podczas mycia skrawków należy przygotować wtórne roztwory przeciwciał w stężeniu 1:200, dodając przeciwciała do roztworu przeciwciała (np. kozy anty-królika 594 lub kozy anty-kurczaka 488). Wirować krótko, a następnie wirować przez 5 minut w temperaturze ≥ 4 000 x g w temperaturze 4 °C.
- Inkubować skrawki w przeciwciałie drugorzędowym przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Chroń skrawki przed światłem podczas tego etapu i wszystkich następnych kroków, aby złagodzić bielenie przeciwciał drugorzędowych.
- Po wtórnej inkubacji przeciwciał odessać TBST dnia 2 z dołków płuczkowych, dodać 1 ml nowego TBST do każdej studzienki płuczącej i przenieść sekcje do pierwszej studzienki do płukania. Umyj sekcje 3x w TBST przez 10 min każda.
- Podczas końcowego mycia wyjmij materiał montażowy z 4 °C i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej. Przygotuj mieszaninę 2:1 1x TBS: wody destylowanej i dodaj ją do szalki Petriego. Przygotować szkiełko mikroskopowe, dodając do powierzchni 800 μl 2:1 TBS:dH2O
UWAGA: Zdecydowanie zaleca się używanie nieutwardzalnych nośników montażowych. Utwardzanie podłoża montażowego może zmienić objętość tkanki, co może zakłócić analizę objętości terytorium astrocytów. Przepis na prosty i niedrogi domowy nośnik montażowy znajduje się w Tabeli materiałów.
- Za pomocą drobnego pędzla przenieś sekcje pojedynczo z dołka Wash 3 na szalkę Petriego. Ten krok usuwa tryton i pomaga spłaszczyć sekcje. Następnie przenieś skrawki z szalki Petriego do cieczy na szkiełku.
- Użyj pędzla, aby ułożyć sekcje tak, aby były płaskie na slajdzie. Ostrożnie usunąć nadmiar płynu z szkiełka za pomocą pipety P1000, a następnie zasysać próżniowo.
UWAGA: Dodaj końcówkę pipety P200 na końcu pipety Pasteura, aby dokładniej kontrolować zasysanie próżniowe.
- Po usunięciu całego nadmiaru płynu ze szkiełka należy użyć pipety transferowej, aby natychmiast dodać jedną kroplę podłoża montażowego do każdej sekcji i delikatnie położyć szkiełko nakrywkowe na szkiełku. Pozwól nośnikowi montażowemu rozprzestrzenić się przez kilka minut, a następnie usuń nadmiar materiału montażowego, który wydostaje się spod szkiełka nakrywkowego przez zasysanie próżniowe.
UWAGA: Nie pozwól, aby sekcje wyschły przed dodaniem nośnika montażowego. Jeśli skrawki zaczną wysychać przed dodaniem podłoża montażowego, może to wpłynąć na objętość tkanki i utrudnić dokładne zbieranie danych.
- Uszczelnij wszystkie cztery krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj je płasko w temperaturze 4 °C. Odczekaj co najmniej 2 godziny przed obrazowaniem lub zobrazuj następnego dnia.
UWAGA: Skrawki wybarwione przeciwciałami przeciwko GFP (białek zielonej fluorescencji) i RFP (białek czerwonej fluorescencji) mogą być przechowywane do 2 tygodni przed obrazowaniem, pod warunkiem, że są całkowicie uszczelnione lakierem do paznokci.
