$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Cięcie tkanki
- Wytnij mały kawałek tkanki (~1 cm x 1 cm) do przekrojenia. Włóż pozostałą chusteczkę do zamrażarki z suchym lodem/-80 °C.
UWAGA: Upewnij się, że sekcja tkanki składa się w ~95% z kory móżdżku, gdzie znajdują się komórki Purkinjego.
- Umieść kopiec OCT o wysokości około 3 mm, aby przykryć "uchwyt". Zacznij od budowania warstw na wierzchu powolnym, okrężnym ruchem, aż pojawi się mały kopiec.
- Gdy OCT jest częściowo zamrożony, ale nadal ma trochę płynu w środku, umieść na nim tkankę. Nie wpychaj tkanki głęboko do OCT. Pozwól chusteczce usiąść na niej, aż całkowicie się zamrozi, co zajmie 1-2 minuty.
- Umieść "uchwyt" z zamrożonym OCT i tkanką w ramieniu tnącym kriostatu. Wyreguluj tkankę tak, aby zlicowała się z ostrzem tnącym.
- Pozostaw tkankę w ramieniu tnącym na 15–20 minut, aby dostosować się do nowej temperatury.
UWAGA: W zależności od grubości tkanki, potrzebny jest czas na aklimatyzację do temperatury. Pozwól chusteczce siedzieć tak długo, jak to konieczne, aby ciąć czysto. Dostosuj OT i CT, aby pomóc w aklimatyzacji do temperatury tkanek.
- Powoli przesuwaj tkankę bliżej ostrza. Gdy tkanka dotrze do ostrza, rozpocznij proces przycinania. Grubość przycinania powinna być ustawiona na 30 μm.
- Przytnij 2–3 razy, aż warstwy kory będą widoczne.
- Umieść i wyrównaj płytkę zabezpieczającą tuż nad ostrzem kriostatu.
UWAGA: Srebrna linia pojawi się ze światła w kriostacie na styku ostrza i płytki zabezpieczającej. Oznacza to, że płyta stabilizująca przechylanie się znajduje się bezpośrednio nad krawędzią ostrza.
- Rozpocznij cięcie sekcji z prędkością 14 μm. Prawidłowo przycięte odcinki będą płasko pod płytą stabilizatora.
UWAGA: Jeśli chusteczka jest zablokowana, upewnij się, że płytka zabezpieczająca jest wystarczająco zimna. W razie potrzeby umieszczenie kawałka suchego lodu na zewnątrz (strona nie dotykająca sceny) szybko schłodzi płytę stabilizacyjną.
- Wytnij 4–6 sekcji i wyrównaj je poziomo w poprzek stolika kriostatu.
- Ustawiając szkiełko pod kątem, podnieś wszystkie kawałki tkanki za jednym razem.
UWAGA: Używając szczotek, podnieś końce chusteczki do góry, aby były łatwiej dostępne do szkiełka po podniesieniu do podnoszenia. Nie podnoś jednej sekcji na raz. Wystawienie na działanie powietrza o temperaturze pokojowej pogorszy integralność RNA.
UWAGA: Nie pozwól, aby membrana dotykała stopnia kriostatu. Jeśli membrana dotknie stolika, zacznie odłączać się od szkiełka i spowoduje błędy podczas próby LCM.
- Natychmiast przejdź do kroku 6. Nie zwlekaj z fiksacją.
2. Utrwalanie wizualizacji tkankowej/bez plam
- Natychmiast przejdź do protokołu utrwalania etanolu
- Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka z 70% etanolem na 2 minuty — na lodzie.
- Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka z 95% etanolem na 45 s — na lodzie.
- Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka ze 100% etanolem na 2 minuty — w temperaturze RT.
- Zanurz szkiełko 3 razy w uchwycie szkiełka z ksylenem 1 — przy RT.
- Umieść szkiełko w uchwycie szkiełek z ksylenem 2 na 5 minut — w temperaturze RT.
- Pozostaw do wyschnięcia w czystym miejscu na co najmniej 30 minut. Optymalny jest dłuższy czas schnięcia, do 60 minut.
UWAGA: Używaj szkiełek stojących do suszenia w dygestorium. Ksylen jest lotny. Ułożenie szkiełek płasko spowoduje gromadzenie się ksylenu w części tkanki, co sprawi, że tkanka będzie zbyt ciemna.
3. Rozmrażanie przechowywanych preparatów do użytku
- Wyjąć probówkę jednym szkiełkiem z zamrażarki w temperaturze -80 °C na 1 godzinę przed planowanym użyciem.
- Nie otwieraj rurki od razu. Pozwól, aby rurka osiągnęła temperaturę pokojową. Kondensacja wystąpi tylko na zewnątrz rury.
- Gdy rurka osiągnie temperaturę pokojową i cała kondensacja zniknie (około 30–40 min), zdejmij nakrętkę i wystawij szkiełko na działanie powietrza o temperaturze pokojowej.
- Pozwól szkiełku zaaklimatyzować się do temperatury pokojowej przez 15–20 minut. Następnie pozostaw go w tubce ze zdjętą nakrętką.
UWAGA: Slajd jest teraz gotowy do LCM.
4. Laserowa mikrodysekcja komórek Purkinjego:
UWAGA: Ta sekcja protokołu będzie omawiać tylko szczegóły związane z przechwytywaniem komórek Purkinjego do późniejszego sekwencjonowania RNA. W tej sekcji założono, że użytkownik jest zaznajomiony z mikroskopem laserowym UV i powiązanym oprogramowaniem.
- Wyczyść stolik mikroskopu i ramię zbierające nakrętki za pomocą odkażacza RNazy.
- Rękami w rękawiczkach umieść szkiełko na mikroskopie, a nieprzezroczystą nasadkę o pojemności 500 μl w ramieniu zbiorczym.
UWAGA: Zawsze upewnij się, że technika RNA jest prawidłowa, czyszcząc obszar roboczy dekontaminatorem RNazy i używając rąk w rękawiczkach podczas dotykania szkiełka lub nieprzezroczystej nasadki. Rękawice można zdjąć, gdy zamek i nasadka są na swoim miejscu i rozpocznie się przechwytywanie laserowe.
- Przy małym powiększeniu wyrównaj nieprzezroczystą nasadkę na tkance móżdżku, upewniając się, że nasadka obejmuje cały obszar widoczny w okularze.
UWAGA: Tylko okular mikroskopu pokaże, czy nieprzezroczysta nasadka jest wyśrodkowana. Aparat nie pokaże, jeśli nasadka jest wyśrodkowana nad tkanką. W zależności od konstrukcji lunety do przechwytywania laserowego, wizualizacja przez nieprzezroczystą nasadkę będzie albo tylko w okularze, albo wizualizowana zarówno w okularze, jak i w aparacie.
- Wizualizuj warstwy móżdżku za pomocą soczewki obiektywu 5x - 10x i umieść kursor na sekcji, w której przecinają się warstwa molekularna i warstwa komórek ziarnistych (warstwa komórek Purkinjego).
- Przejdź do 40X i wizualizuj komórki Purkinjego.
UWAGA: Zobacz Rysunek 1 i Rysunek 2 dla przykładowych wizualizacji.
- Rozpocznij przechwytywanie komórek Purkinjego.
UWAGA: Do przeprowadzenia sekwencjonowania RNA wymagane jest co najmniej 5 ng RNA. Około 1600–2000 komórek Purkinjego wytwarza wystarczającą ilość materiału RNA do sekwencjonowania. RNA będzie stabilne do 8 godzin pod mikroskopem. Przetestuj energię UV i ogniskowanie UV przed pobraniem, aby upewnić się, że poziomy są prawidłowe. Z biegiem czasu tkanka będzie nadal wysychać, a energia UV i ognisko UV mogą wymagać zmiany.
