$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przechowywanie mózgów
- Szybko usuń mózgi z poddanych eutanazji dorosłych myszy typu dzikiego CD1 o wadze około 30 g przy użyciu konwencjonalnego podejścia i błyskawicznego zamrażania przez 60 sekund w ciekłym azocie lub izopentanie wstępnie schłodzonym suchym lodem.
- Zamrożone mózgi należy przechowywać w temperaturze -80 °C w folii aluminiowej lub stożkowych probówkach do czasu użycia.
2. Przygotowanie matrycy mózgu
- Dwadzieścia cztery godziny przed sekcją tkanki umieść czystą matrycę mózgu na stosie rozmrożonych opakowań do zamrażania. Umieść boki matrycy między dwoma opakowaniami zamrażarki, upewniając się, że pozostawiono około 0,5 cm między dolną częścią szczelin maszynki do golenia a górną częścią wkładów żelowych (Rysunek 1A). Umieść folię aluminiową na końcach, aby pomóc w chłodzeniu.
UWAGA: Kupując matrycę mózgu, kup taką, która jest wystarczająco duża, aby objąć całą objętość mózgu, który ma być poddany sekcji.
- Umieść na noc pudełko zawierające matrycę mózgu i opakowania do zamrażania w zamrażarce o temperaturze -20 °C z uchyloną górną częścią.
3. Ustawianie zamrożonego szklanego talerza
UWAGA: Celem tego zestawu jest przygotowanie zamrożonej powierzchni, na której zostaną przeprowadzone sekcje mózgu.
- Umieść lód w izolowanym pudełku w odległości do około 5 cm od góry. Następnie umieść 2,5 cm warstwę suchego lodu na wierzchu lodu i przykryj czarną folią z tworzywa sztucznego, aby pomóc w wizualizacji próbki (Rysunek 1B, Rysunek 1C).
- Umieść szklaną płytkę (powinna zmieścić się w otworze pudełka) na plastiku i umieść suchy lód na wierzchu talerza w odległych rogach (Rysunek 1C).
- Wyjmij zamrożoną macierz mózgową z zamrażarki i włóż mózg, który ma zostać przecięty korą do góry. Pozwól mu wyrównać się do temperatury w pudełku przez 10 minut. W tym czasie trzymaj pokrywę pudełka.
- Dostosuj pozycję mózgu w macierzy za pomocą zimnych kleszczy tak, aby zatoka strzałkowa i zatoka poprzeczna pokrywały się z prostopadłymi rowkami bloku (Rysunek 1D). Pomoże to zapewnić symetryczne przekroje dla łatwiejszej sekcji. Dotknij końcówek kleszczy do suchego lodu na krótko, aby schłodzić się przed dostosowaniem mózgu.
- Gdy mózg znajdzie się na swoim miejscu, umieść schłodzoną żyletkę w pobliżu jej środka i wciśnij ostrze na około 1 mm w tkankę. Dodaj schłodzone ostrza do końców rostralnych i ogonowych, aby pomóc utrzymać mózg na miejscu (Rysunek 2A i Rysunek 2B).
- Zaczynając od końca rostralnego, dodawaj ostrza pojedynczo, umieszczając je w szczelinach i delikatnie wciskając w tkankę na około 1 mm (Rysunek 2B). Kontynuuj dodawanie ostrzy w odstępach 1 mm, kierując się w stronę końca ogonowego.
- Upewnij się, że w tym czasie mózg się nie przesuwa. Ustaw ostrza poziomo i pionowo (Rysunek 2B). Niskoprofilowe ostrza mikrotomowe mogą być używane do cięcia sekcji o szerokości 0,5 mm. Umieść je między większymi żyletkami (Rysunek 2C).
- Gdy ostrza znajdą się na miejscu, dociśnij górną część grupy palcami, dłonią lub inną płaską powierzchnią (Rysunek 2C, Rysunek 2D). Kołysz grupą ostrzy powoli z boku na bok, aby przesuwać je przez tkankę.
UWAGA: Może to zająć trochę czasu (1-2 min) i wymaga cierpliwości. Powinien istnieć opór dla ostrzy poruszających się po tkance. Łatwe wejście oznacza, że mózg się rozmraża, a blok powinien być chłodzony suchym lodem.
- Gdy wszystkie ostrza dotrą do dna szczelin, chwyć każdą stronę grupy ostrzy i kołysz się w przód iw tył, aby uwolnić się od matrycy.
UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby nie skaleczyć się o ostre krawędzie ostrzy.
- Gdy grupa będzie wolna, połóż stos rostralną stroną do góry na szklanej płycie (Rysunek 2E). Umieść suchy lód obok i/lub na szczycie stosu, aby jeszcze bardziej zamrozić próbki w celu łatwiejszego oddzielenia.
- Połóż stos ostrymi krawędziami w dół na szklanej płycie i oddziel ostrza, przesuwając stos między kciukami i palcami. Ostrza powinny oddzielać się od siebie za pomocą dołączonych sekcji.
- Ułóż sekcje na szklanej płycie od rostralnego do ogonowego (Rysunek 2F).
- Oddziel tkankę od ostrzy, zginając ostrza między palcami lub oddzielając je drugą zimną brzytwą (Ryciny 2G, 2H, 2I).
4. Sekcja analizująca
- Otwórz atlas mózgu myszy Allen lub inne odniesienie i znajdź punkty orientacyjne niezbędne do zidentyfikowania interesujących regionów. Niektóre oczywiste punkty orientacyjne to spoidło przednie, ciało modzelowate, komory boczne i hipokamp (Rysunek 3).
- Odwróć sekcję do cięcia za pomocą schłodzonych kleszczy i upewnij się, że obszar, który ma zostać pobrany, jest spójny przez cały czas. Podczas zbiorów należy często korzystać z atlasu referencyjnego, aby upewnić się, że uzyskano prawidłowy zwrot z inwestycji.
UWAGA: Lupa lub mikroskop preparacyjny są często pomocne w tym procesie. Niezbędne jest również dobre oświetlenie. Do tego celu można użyć lamp LED o niskiej mocy lub chłodnej lampy.
- Czystym skalpelem lub dziurkaczem wytnij sekcję (Rysunek 4). Schłodź każde narzędzie przed cięciem, dotykając go krótko, aby uzyskać suchy lód. Wciśnij ostrze delikatnie, ale stanowczo w tkankę, kołysząc nim w przód iw tył, aby wykonać cięcie. Nie naciskaj zbyt mocno, bo tkanka pęknie.
UWAGA: Narzędzia nagrzewają się z czasem. Lekko rozgrzane ostrza mogą pomóc w wykonaniu czystych cięć i ograniczeniu pęknięć, ale należy uważać, aby nie rozmrozić tkanki. Okresowo schładzaj narzędzia na suchym lodzie.
- Po zebraniu ROI umieść go w oznakowanych, wstępnie schłodzonych probówkach o pojemności 1.5 ml. Pobrane tkanki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
