Generowanie modelu hodowli narządów w celu symulacji wczesnego stadium choroby krążka międzykręgowego

Streszczenie

Źródło: Saravi, B. i inni., Prozapalny, zwyrodnieniowy model hodowli narządów do symulacji wczesnego stadium choroby krążka międzykręgowego. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film pokazuje rozwój prozapalnego i zwyrodnieniowego modelu hodowli narządów we wczesnym stadium choroby krążka międzykręgowego (IVD) przy użyciu TNF-α. Przedstawiono w nim procedurę wstrzykiwania TNF-α do krążka międzykręgowego i wyjaśniono mechanizmy, za pomocą których TNF-α indukuje stan zapalny i degradację IVD.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Posiew i obciążenie krążka międzykręgowego (IVD)

1. Przenieść krążki międzykręgowe (IVD) do komór IVD i dodać pożywkę hodowlaną IVD (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L DMEM o wysokiej zawartości glukozy dla grupy fizjologicznej i 2 g/L DMEM o niskiej zawartości glukozy dla grupy patologicznej) + 1% penicyliny/streptomycyny + 2% płodowej surowicy cielęcej + 1% ITS (zawiera 5 μg/ml insuliny, 6 μg/ml transferyny i 5 ng/ml kwasu selenowego) + 50 μg/ml 2-fosforanu askorbinianu + 1% aminokwasu endogennego + 50 μg/ml środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek pierwotnych) i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, wilgotności 85% i 5% CO₂.
2. Hoduj dyski przez 4 dni w systemie bioreaktora zgodnie z grupami eksperymentalnymi. W grupie patologicznej utrzymuj warunki obciążenia zwyrodnieniowego na poziomie 0,32-0,5 MPa, 5 Hz przez 2 godziny/dobę. W fizjologicznej grupie kontrolnej należy stosować protokół obciążenia 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz przez 2 godziny dziennie.
   UWAGA: Umieść IVD w komorach zawierających 5 ml pożywki IVD podczas procedur ładowania. Objętość zależy od wielkości komór załadowczych bioreaktora. Pomiędzy procedurami ładowania umieścić IVD w sześciodołkowych płytkach z 7 ml pożywki do IVD w celu odzyskania swobodnego pęcznienia.
3. W celu analizy zmian wysokości krążka w okresie eksperymentalnym, należy zmierzyć wysokość dysku suwmiarką po rozwarstwieniu IVD (linia wyjściowa), a następnie codziennie po okresie swobodnego pęcznienia i po obciążeniu dynamicznym przez czas trwania eksperymentu.

2. Wstrzyknięcie czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α)

1. Bezpośrednio po pierwszym cyklu dynamicznego ładowania w dniu 1 umieść IVD na szalce Petriego w pozycji pionowej i ustabilizuj IVD za pomocą pęsety.
2. Wstrzyknąć rekombinowany TNF-α (100 ng w 70 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na IVD) za pomocą igły insulinowej o rozmiarze 30 do tkanki jądra miażdżystego grupy patologicznej. Wstrzykiwać powoli z prędkością około 70 μl w ciągu 1 minuty.
3. Po wstrzyknięciu należy wciągnąć strzykawkę do połowy z powrotem w IVD i pociągnąć tłok strzykawki, aby wytworzyć podciśnienie, które zapobiegnie cofaniu się wstrzykniętego roztworu przed całkowitym wyjęciem igły i strzykawki z IVD.
   UWAGA: Przeprowadź eksperyment pilotażowy, wstrzykując PBS zawierający barwnik błękitu trypanowego, aby ocenić rozkład wstrzykniętego roztworu po załadowaniu i nocnej hodowli.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-fosforan askorbinianu	Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone	A8960
TNF-alfa, rekombinowane białko ludzkie	Systemy badawczo-rozwojowe, Minnesota, USA	210-TA-005
Bydło IL-8 Zrób to sam ELISA	Kingfisher Biotech, St. Paul, Stany Zjednoczone	DIY1028B-003
Corning ITS Premix	Corning Inc., Nowy Jork, Stany Zjednoczone	354350
DMEM o wysokiej zawartości glukozy	Gibco by life technologies, Karlowe Wary, USA	10741574
DMEM o niskim poziomie glukozy	Gibco by life technologies, Karlowe Wary, USA	11564446
Etanol w biologii molekularnej	Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone	09-0851
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Gibco by life technologies, Karlowe Wary, USA	A4766801
Nieistotny roztwór aminokwasów	Gibco by life technologies, Karlowe Wary, USA	11140050
Penicylina/Streptomycyna(P/S)	gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11548876
Bufor fosforanowy, tabletka	Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone	P4417
Primocin	InvivoGen, Sandiego, Stany Zjednoczone	ant-pm-05