Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały poddane przeglądowi przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz przegląd weterynaryjny JoVE.
1. Przygotowanie przed pobraniem tkanki
- Ustaw wirówkę na 4 oC.
- Wypoleruj ogniowo zestaw trzech szklanych pipet Pasteura o zmniejszających się średnicach około 1,3, 0,8 i 0,4 mm dla każdej próbki.
- Przygotować oznakowane probówki o pojemności 1,7 ml zawierające 1 ml zimnego buforu A i przechowywać probówki na lodzie.
- Przygotuj tackę na lód zawierającą matrycę do krojenia mózgu, szpatułki i szklane talerze (lub odwróconą szklaną szalkę Petriego), na której przeprowadzisz sekcję. Wstępnie schłodź dwie lub więcej żyletek na szklanych płytkach i użyj bibułki do wysuszenia wszystkich narzędzi, które dotykają chusteczki.
- Rozmrażać roztwór enzymu w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut przed pobraniem tkanki.
2. Pobieranie i sekcja tkanek
- Leczenie behawioralne lub farmakologiczne należy rozpocząć na 90 minut przed pobraniem tkanki.
UWAGA: Dla pokazanych tutaj wyników, wykonano ostre wstrzyknięcia dootrzewnowe 5 mg/kg metamfetaminy szczurom w nowym środowisku (warunek testowy) i naiwnym szczurom trzymanym w klatkach domowych (warunki kontrolne).
- Znieczulij szczura, umieszczając go w szklanym słoiku z eksykatorem z nasyconym izofluranem i odetnij szczurowi głowę 30 - 60 sekund później za pomocą gilotyny.
Użyj nożyczek, aby usunąć skórę i mięśnie z głowy i odsłonić czaszkę. Użyj rongeurs, aby przeciąć czaszkę, otworzyć otwór wielki i usunąć tylną część czaszki. Użyj rongeurs, aby przeciąć wzdłuż górnych krawędzi czaszki, aby odsłonić mózg. Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu. Użyj małej szpatułki, aby delikatnie zgarnąć i podnieść mózg. Podnieś mózg i przetnij nerwy, aż mózg będzie wolny.
- Wypreparuj tkankę za pomocą żyletek.
UWAGA: Próbki tkanek należy pobrać przy użyciu jednej z następujących metod: (2.3.1) świeżo wypreparowana tkanka; (2.3.2) zamrożona tkanka po sekcji; lub (2.3.3) zamrożoną tkankę wypreparowaną z zamrożonego całego mózgu. Utrzymuj matrycę do krojenia mózgu, żyletki i szklaną płytkę suchą podczas procesów sekcji i mielenia, ponieważ skondensowana woda może prowadzić do hipotonicznej lizy komórek. Użyj szkieł powiększających, aby zapewnić dokładne rozwarstwienie.
- W przypadku świeżo wypreparowanej tkanki umieść świeżo wyekstrahowany mózg w matrycy do krojenia mózgu (metalowa forma w kształcie mózgu szczura ze szczelinami na żyletki w odstępach 1 mm), która została schłodzona na lodzie. Włóż dwie lub więcej wstępnie schłodzonych żyletek do szczelin, aby wyciąć plastry koronalne, które zawierają interesujący obszar (obszary) mózgu. Połóż pokrojony plasterek na schłodzonej szklanej płycie.
Uwaga: Przeanalizuj interesujące Cię obszary mózgu na schłodzonej szklanej płytce.
- W przypadku zamrożonej tkanki po rozbiorze, należy wypreparować obszar (obszary) mózgu będący przedmiotem zainteresowania z wycinków świeżo wyekstrahowanego mózgu, podobnie jak opisano to powyżej w ppkt 2.3.1. Wypreparowaną tkankę umieścić w mikroprobówce i szybko zamrozić tkankę, zanurzając mikroprobówkę w izopentanie o temperaturze -40 ºC na 20 sekund. Wypreparowaną tkankę należy przechowywać przez cały czas zamrożoną w zamrażarce w temperaturze -80 ºC do czasu dalszej obróbki.
- W przypadku zamrożonej tkanki świeżo wyekstrahowany mózg należy natychmiast zamrozić w izopentanie o temperaturze -40 ºC i przechowywać w szczelnie zamkniętej torbie w temperaturze -80 ºC przez okres do 6 miesięcy.
- W dniu sekcji należy umieścić zamrożony mózg w kriostacie ustawionym na około -20 ºC (nie cieplejszym niż -18 ºC) na około 2 godziny w celu zrównoważenia temperatury.
UWAGA: Mózg można łatwo przeciąć w tej temperaturze, podczas gdy znacznie niższe temperatury sprawiają, że mózg jest zbyt kruchy, aby można go było bezpiecznie przeciąć.
- Użyj żyletek, aby pokroić 1-2 mm plastry koronalne zamrożonych mózgów w kriostacie. W warunkach zamrażania użyj tępej igły o rozmiarze od 12 do 16, aby uzyskać stemple tkanek z tych plasterków. Wypreparowaną tkankę należy przechowywać w pozycji zamrożonej przez cały czas do czasu dalszego przetwarzania.
- Dodaj 1-2 krople buforu A, aby przykryć wypreparowaną tkankę przed mieleniem. Usuń większość istoty białej z tkanki za pomocą dwóch żyletek, aby zapobiec utracie neuronów podczas pozostałej części procesu ciernia. Jeśli zaczynasz od zamrożonej tkanki, pozwól chusteczce rozmrozić się na zimnej szklanej płytce nie dłużej niż 1 minutę przed zastosowaniem roztworu buforu A.
- Zmiel tkankę 100 razy w każdym prostopadłym kierunku za pomocą żyletki na schłodzonej szklanej płytce. Podczas mielenia trzymaj żyletkę pionowo do szklanej płytki.
UWAGA: Dokładne mielenie ma kluczowe znaczenie dla wszystkich etapów protokołu.
- Za pomocą żyletek przenieś zmieloną tkankę do probówek mikrowirówek zawierających 1 ml zimnego buforu A. Odwróć probówkę 3 - 5 razy, aby cała zmielona tkanka pozostała w roztworze.
3. Dysocjacja komórek
UWAGA: Użyj delikatnego mieszania koniec po końcu dla wszystkich poniższych kroków. Nie używaj mieszalnika wirowego i unikaj pęcherzyków powietrza, które powodują uszkodzenie komórek.
- Odwirować probówki z próbkami o stężeniu 110 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Powoli dodaj 1 ml zimnego, świeżo rozmrożonego roztworu enzymatycznego (zawierającego mieszaninę enzymów proteolitycznych) w dół wewnętrznej ścianki mikroprobówki. Natychmiast zassać cały granulat i delikatnie pipetować w górę i w dół tylko 4 razy pipetą o umiarkowanie dużej średnicy końcówki, aby rozproszyć zmielone granulki tkankowe.
- Natychmiast odwróć mikroprobówki, aby zapobiec przywieraniu osadu do dna, i inkubuj próbki, mieszając je od końca do końca przez 30 minut w temperaturze 4 oC.
- Po enzymatycznym trawieniu tkanek odwirować probówki o sile 960 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 0,6 ml zimnego buforu A. Natychmiast po dodaniu buforu A należy użyć tej samej końcówki pipety do rozproszenia osadu poprzez zasysanie całej osadki i delikatnie pipetować w górę i w dół 5 razy.
- Mechanicznie rozcierać strawioną tkankę i zbierać do probówek o pojemności 15 ml, wykonując następujące czynności. Do każdej próbki należy użyć oddzielnego zestawu 3 pipet Pasteura z polerowanego szkła o malejących średnicach około 1,3, 0,8 i 0,4 mm przymocowanych do bańek lateksowych.
- Delikatnie rozetrzeć każdą próbkę 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 1,3 mm. Pozostaw próbkę na lodzie na 2 minuty (szczątki i niezdysocjowane komórki osiądą na dnie). Zebrać sklarowany osad (~ 0,6 ml) i przenieść go do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (probówka #1).
- Dodać 0,6 ml roztworu buforu A do pozostałego osadu. Próbkę należy rozcierać 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 0,8 mm. Pozostaw próbkę na lodzie na 2 minuty. Zebrać supernatant (~ 0,6 ml) i przenieść go do tej samej stożkowej probówki #1 o pojemności 15 ml.
- Dodać 0,6 ml roztworu buforu A do pozostałego osadu. Próbkę należy rozcierać 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 0,4 mm. Pozostaw próbkę na lodzie na 2 minuty. Zebrać supernatant (~ 0,6 ml; bez dotykania osadu z niezdysocjowanymi komórkami) i przenieść do tej samej stożkowej probówki #1 o pojemności 15 ml.
UWAGA: Trzymaj pipetę o średnicy 0,4 mm w probówce #1 do następujących etapów rozcierania.
- Powtórzyć krok 3.4.3 jeszcze trzy razy, używając najmniejszej szklanej pipety (o średnicy ~ 0,4 mm) i zebrać supernatant do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml (probówka #2).
- Zebrane zawiesiny komórek należy rozprowadzić w probówkach #1 i #2 jeszcze 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 0,4 mm i trzymać je na lodzie.
4. Utrwalanie i przepuszczalność komórek
- Przygotuj 4 mikroprobówki na próbkę (dwie mikroprobówki dla komórek z probówki #1 i dwie dla komórek z probówki #2), dodając 800 μl 100% zimnego etanolu (przechowywanego w temperaturze -20 oC przed użyciem) do każdej probówki i trzymaj je na lodzie. Uwaga: Końcowe stężenie etanolu wyniesie 50%.
- Odpipetować ~ 800 μl zawiesin komórek (z probówki #1 i probówki#2) do każdej z 4 probówek zawierających zimny etanol i odwrócić probówki w celu wymieszania próbek.
- Inkubuj probówki na lodzie przez 15 minut, odwracając probówki co 5 minut.
- Po utrwaleniu/przepuszczalności odwirować probówki o stężeniu 1 700 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Pozostaw 50 μl roztworu, aby zapobiec utracie komórek.
UWAGA: Granulki na tym etapie są białe i mniej przylegają do ścianek rurek niż przed przepuszczalnością. Dlatego należy ostrożnie usunąć supernatant, dotykając ścianki mikroprobówki, w której nie ma osadu, i powoli pobrać supernatant za pomocą mikropipety.
5. Filtracja komórkowa
- Ponownie zawiesić granulki z kroku 4.4 za pomocą zimnego PBS w następujący sposób:
- Dodaj 550 μl zimnego PBS do jednej z dwóch mikroprobówek pochodzących z probówki #1 i użyj końcówki pipety o umiarkowanie dużej średnicy, aby delikatnie odpipetować zawiesinę komórek w górę iw dół 5 razy. Powtórz to samo dla jednej mikroprobówki pochodzącej z probówki #2.
- W przypadku komórek z probówki #1, używając tej samej pipety, przenieś pierwszą zawiesinę komórek do drugiej granulki. Zawiesić drugą osadkę, delikatnie pipetując zawiesinę połączonych komórek 5 razy w górę i w dół.
- W przypadku komórek z probówki #2 ponownie zawiesić i połączyć granulki (i.e., trzecia i czwarta mikroprobówka) zgodnie z opisem w 5.1.2.
