$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mikromieszanie reakcji RT
- Przed przeprowadzeniem reakcji RT z mikromieszaniem należy zrównoważyć mikromikser do żądanej temperatury reakcji RT.
- Umieścić mikromikser w inkubatorze o temperaturze 37°C (lub temperaturze zalecanej przez dostawcę RT) na co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem reakcji RT.
- Skonfiguruj mieszankę RT zgodnie z instrukcjami dostawcy odwrotnej transkryptazy (np. MMTV-RT firmy Promega, Omniscript firmy Qiagen), z wyjątkiem użycia jednokomórkowych ilości wejściowego całkowitego RNA (np. 0,1-1pg/μl), zamiast ilości ng-μg zalecanych przez dostawców.
- Używamy standardowych, sterylnych, wolnych od nukleaz cienkościennych probówek PCR o pojemności 200 μl.
- Umieść probówki RT bezpiecznie w mikromikserze, gdy tylko będą gotowe do mieszania. Mikromieszalnik powinien pozostać w inkubatorze o temperaturze 37°C przez czas trwania reakcji RT.
- Wybierz odpowiednią częstotliwość i amplitudę mikromieszania. W tym przykładzie używamy częstotliwości 150 Hz.
- Włączyć mikromikser i pozostawić go włączony na cały czas trwania reakcji RT (60 minut).
- Wyłącz mikromikser i wyjmij rurki RT po zakończeniu reakcji RT.
- Umieść probówki RT na lodzie i postępuj jak zwykle z dalszymi aplikacjami, takimi jak ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR lub real-time PCR).
2. Reprezentatywne wyniki:
Zaletą mikromieszania w kontekście reakcji RT jest wzrost wydajności cDNA w stosunku do sytuacji, gdy stosowane są inne metody mieszania (np. wstrząsanie, wirowanie lub rozcieranie). Można to zaobserwować na przykład po późniejszej analizie cDNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR lub real-time PCR). Rysunek 2A ilustruje efekty mikromieszania przez pierwsze 5 minut (kolor niebieski, "mikromieszany5") lub przez całe 60 minut (kolor czerwony, "mikromieszany60") w porównaniu z mieszaniem reakcji RT bezpośrednio przed inkubacją RT (, "rozcieranie"). W tym przypadku objętość poprzedniej reakcji RT wynosiła 25 μl i zawierała 2,5 pg całkowitego RNA. Ślady qPCR przy użyciu starterów przeznaczonych do wykrywania cDNA reprezentującego mRNA Nurr-1 pokazano powyżej, a średnie ±SEM liczby cykli do osiągnięcia 50% maksymalnej fluorescencji w 3 powtórzeniach tego samego eksperymentu przedstawiono poniżej. Gwiazdka oznacza statystycznie istotną różnicę (jednokierunkowa ANOVA z wielokrotnymi porównaniami Tukeya). Należy zauważyć, że mikromieszanie przez pierwsze 5 minut poprzedniej reakcji RT spowodowało nieistotną poprawę w stosunku do trituracji, podczas gdy mikromieszanie przez całe 60 minut poprzedniej reakcji RT spowodowało znaczną poprawę w trakcie trituracji, której wielkość była równoważna średnio około 15 cyklom qPCR.
Korzyści z mikromieszania można również dostrzec w analizie krzywej topnienia kolejnych otrzymanych produktów qPCR. W eksperymencie zilustrowanym na rysunku 2B, mikromieszanie przez całe 60 minut poprzedzającej reakcji RT skutkowało spójnym sygnałem qPCR w zduplikowanych próbkach (figura 2Ba, 2 czerwone ślady), podczas gdy mikromieszanie przez pierwsze 5 minut lub trituration dawało tylko niespójne ślady qPCR (rysunek 2Ba, odpowiednio 2 niebieskie ślady i 2 czarne ślady). Szare ślady to kontrole ujemne ("neg."), w których cDNA zostało pominięte w reakcji qPCR. Gdy produkty qPCR z tego eksperymentu zostały zdenaturowane przez zwiększenie ich temperatury (tj. analizę krzywej topnienia), okazało się, że odpowiednie produkty PCR (tj. amplikon identyczny z tym, który uzyskano, gdy znacznie wyższe stężenia mRNA zostały poddane odwrotnej transkrypcji i amplifikacji przez qPCR, danych nie pokazano) były obecne tylko po reakcjach RT, które były mikromieszane przez 60 minut (Figura 2Bb, 2 czerwone ślady). We wszystkich pozostałych badaniach (tj. mikromiksie5, trituracji i kontroli ujemnej) wykorzystano alternatywne produkty amplikonowe (np. dimery starterów).
Rysunek 1. Schemat przepływu protokołu stosowania mikromieszania do standardowych laboratoryjnych reakcji RT. Bardziej szczegółowe opisy zastosowanej zasady działania mikromiksera oraz sposobu budowy mikromiksera we własnym zakresie znajdują się w piśmiennictwie 13,14
Rysunek 2.Reprezentatywne dane qPCR ilustrujące korzyści płynące z mikromieszania zastosowanego do poprzednich reakcji RT obejmujących jednokomórkowe ilości mRNA w normalnych laboratoryjnych reakcjach RT. Przykładowe ślady qPCR wykrywające cDNA reprezentujące mRNA kodujące gen Nurr-1. Poprzednie reakcje RT zawierały 2,5 pg całkowitego RNA w objętości 25 μl i prowadzono w inkubatorze w temperaturze 37°C przez 60 minut. Reakcje RT mieszano przez rozcieranie mieszaniny RT przed inkubacją (czarne ślady, "rozcieranie"), mikromieszano przez pierwsze 5 minut reakcji RT (niebieskie ślady, "mikromieszano5") lub mikromieszano przez całe 60 minut reakcji RT (czerwone ślady, "mikromieszany60"). Średnie± SEM liczby cykli qPCR wymaganych do osiągnięcia 50% maksymalnej fluorescencji są wykreślone poniżej dla n=3 powtórzeń tego eksperymentu. Gwiazdka wskazuje na istotną różnicę (jednokierunkowa ANOVA z wielokrotnymi porównaniami Tukeya). B Kolejny eksperyment qPCR badający produkt cDNA Nurr-1, tym razem po reakcjach RT zawierających 25pg całkowitego RNA w objętości 25 μL. Przedstawiono ślady qPCR (a) oraz analizę krzywej topnienia otrzymanych produktów qPCR (b) dla różnych warunków mieszania. Uwzględnia się również kontrole ujemne, w których nie uwzględniono cDNA w poprzedzającej reakcji RT (szare ślady, "neg."). Przeprowadzono również reakcje RT ze znacznie wyższymi stężeniami mRNA, w wyniku których piki krzywej topnienia (dane nie pokazano) identyczne jak w (b) dla próbek mikromieszanych60 (czerwone ślady).