Opisujemy nową metodę zwiększania wydajności cDNA z ilości mRNA pochodzących z pojedynczych komórek w standardowych laboratoryjnych reakcjach odwrotnej transkrypcji. Nowatorstwo tej metody polega na zastosowaniu mikromiksera, który wykorzystuje zjawisko akustycznego mikrostrumieniowania do bardziej efektywnego mieszania cieczy w skalach mikrolitrowych niż w przypadku wstrząsania, wirowania w vortexie czy trituracji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zwiększenie wydajności cDNA z ilości mRNA odpowiadających pojedynczym komórkom w standardowych laboratoryjnych reakcjach odwrotnej transkrypcji z wykorzystaniem akustycznego mikrostrumieniowania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Korelowanie ekspresji genów z zachowaniem komórek najlepiej przeprowadzać na poziomie pojedynczych komórek. Nie jest to jednak łatwe do osiągnięcia, ponieważ niewielka ilość labilnego mRNA obecna w pojedynczej komórce (1-5% z 1-50pg całkowitego RNA, czyli 0,01-2,5pg mRNA na komórkę 1) ulega w większości degradacji, zanim zostanie poddana odwrotnej transkrypcji do stabilnej kopii cDNA. Na przykład, przy użyciu standardowych odczynników i sprzętu laboratoryjnego, na poziomie pojedynczej komórki można jakościowo ocenić jedynie niewielką liczbę genów 2. Jednym ze sposobów zwiększenia wydajności standardowych laboratoryjnych reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) (tj. standardowych odczynników w objętościach mikrolitrowych) obejmujących ilości mRNA z pojedynczych komórek byłoby szybsze mieszanie odczynników, aby mRNA mogło zostać przekształcone w cDNA przed jego degradacją. Nie jest to jednak trywialne, ponieważ w skali mikrolitrowej przepływ cieczy jest laminarny, co oznacza, że obecnie dostępne metody mieszania (tj. wstrząsanie, wiroksowanie i trituracja) nie wywołują wystarczającego ruchu chaotycznego, aby skutecznie wymieszać odczynniki. Aby rozwiązać ten problem, należy zastosować techniki mieszania w mikroskali 3,4. Opracowano szereg technologii mieszania opartych na mikrofluidyce, które skutecznie zwiększają wydajność reakcji RT 5-8. Jednak technologie mikrofluidyczne wymagają specjalistycznego sprzętu, który jest stosunkowo drogi i nie jest jeszcze powszechnie dostępny. Pożądane jest rozwiązanie tańsze i wygodniejsze. Głównym celem niniejszego badania jest wykazanie, w jaki sposób zastosowanie nowej techniki „mikromieszania” do standardowych laboratoryjnych reakcji RT obejmujących ilości mRNA z pojedynczych komórek znacząco zwiększa wydajność uzyskiwanego cDNA. Stwierdziliśmy, że wydajność cDNA wzrasta około 10-100-krotnie, co umożliwia: (1) analizę większej liczby genów w pojedynczej komórce; (2) bardziej ilościową analizę ekspresji genów; oraz (3) lepszą detekcję genów o niskiej obfitości w pojedynczych komórkach. Mikromieszanie opiera się na akustycznym mikrostrumieniowaniu 9-12, zjawisku, w którym fale dźwiękowe rozprzestrzeniające się wokół małej przeszkody tworzą średni przepływ w pobliżu tej przeszkody. Opracowaliśmy urządzenie oparte na akustycznym mikrostrumieniowaniu („mikromikser”) z kluczowym uproszczeniem; akustyczne mikrostrumieniowanie można osiągnąć przy częstotliwościach audio, zapewniając, że system posiada granicę ciecz-powietrze o małym promieniu krzywizny 13. Menisk roztworu o objętości mikrolitrowej w probówce zapewnia odpowiednio mały promień krzywizny. Zastosowanie częstotliwości audio oznacza, że sprzęt może być tani i wszechstronny 13, a kwasy nukleinowe i inne odczynniki biochemiczne nie ulegają uszkodzeniom, co może zdarzyć się w przypadku standardowych sonikatorów laboratoryjnych.
Protokół
1. Mikromieszanie reakcji RT
- Przed przeprowadzeniem reakcji RT z zastosowaniem mikromieszania, doprowadź mikromieszacz do temperatury wymaganej dla reakcji RT.
- Umieść mikromieszacz w inkubatorze ustawionym na 37°C (lub temperaturę zalecaną przez dostawcę zestawu RT) na co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem reakcji RT.
- Przygotuj mieszaninę RT zgodnie z instrukcjami dostawcy odwrotnej transkryptazy (np. MMTV-RT od firmy Promega, Omniscript od firmy Qiagen), z wyjątkiem ilości wejściowego całkowitego RNA, dla której należy zastosować ilości odpowiadające pojedynczej komórce (np. 0,1-1pg/μl) zamiast ilości rzędu ng-μg zalecanych przez dostawców.
- Stosujemy standardowe sterylne, wolne od nukleaz cienkościenne probówki PCR o pojemności 20μL.
- Bezpiecznie umieść probówki RT w mikromieszaczu natychmiast po ich przygotowaniu do mieszania. Mikromieszacz powinien pozostać w inkubatorze 37°C przez cały czas trwania reakcji RT.
- Wybierz odpowiednią częstotliwość i amplitudę mikromieszania. W tym przykładzie stosujemy 150Hz.
- Włącz mikromieszacz i pozostaw go włączonego przez cały czas trwania reakcji RT (60 minut).
- Wyłącz mikromieszacz i wyjmij probówki RT po zakończeniu reakcji RT.
- Umieść probówki RT na lodzie i kontynuuj standardowo dalsze etapy, takie jak ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR lub PCR w czasie rzeczywistym).
2. Reprezentatywne wyniki:
Korzyścią z zastosowania mikromieszania w kontekście reakcji RT jest zwiększenie wydajności cDNA w porównaniu do stosowania innych metod mieszania (np. wstrząsania, wortexowania lub trituracji). Można to zaobserwować na przykład podczas następującej analizy cDNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR lub PCR w czasie rzeczywistym). Rysunek 2A ilustruje efekty mikromieszania przez pierwsze 5 minut (kolor niebieski, „micromixed5”) lub przez pełne 60 minut (kolor czerwony, „micromixed60”) w porównaniu z trituracją reakcji RT bezpośrednio przed inkubacją RT (kolor czarny, „trituration”). W tym przypadku objętość poprzedzającej reakcji RT wynosiła 25μL i zawierała 2,5pg całkowitego RNA. Powyżej przedstawiono krzywe qPCR z użyciem starterów zaprojektowanych do wykrywania cDNA reprezentującego mRNA Nurr-1, a poniżej wykreślono średnie ±BŁS liczby cykli potrzebnych do osiągnięcia 50% maksymalnej fluorescencji w 3 powtórzeniach tego samego eksperymentu. Gwiazdka oznacza różnicę statystycznie istotną (jednoczynnikowa analiza ANOVA z wielokrotnym porównaniem Tukey). Należy zauważyć, że mikromieszanie przez pierwsze 5 minut poprzedzającej reakcji RT spowodowało nieistotną poprawę w stosunku do trituracji, podczas gdy mikromieszanie przez pełne 60 minut poprzedzającej reakcji RT spowodowało istotną poprawę w stosunku do trituracji, której skala wynosiła średnio około 15 cykli qPCR.
Korzyści z mikromieszania można zauważyć również w analizie krzywych topnienia uzyskanych produktów qPCR. W eksperymencie przedstawionym na Rysunku 2B, mikromieszanie przez pełne 60 minut poprzedzającej reakcji RT doprowadziło do uzyskania spójnego sygnału qPCR w próbkach powtórzonych (Rysunek 2Ba, 2 czerwone linie), podczas gdy mikromieszanie tylko przez pierwsze 5 minut lub samo trituracje spowodowały uzyskanie niespójnych linii qPCR (Rysunek 2Ba, odpowiednio 2 niebieskie linie i 2 czarne linie). Szare linie to kontrole negatywne („neg.”), w których z reakcji qPCR pominięto cDNA. Po denaturacji produktów qPCR z tego eksperymentu poprzez stopniowe zwiększanie temperatury (tj. analiza krzywej topnienia) okazało się, że odpowiednie produkty PCR (tj. amplikon identyczny z uzyskanym po odwrotnej transkrypcji i amplifikacji qPCR znacznie wyższych stężeń mRNA, dane niepokazane) wystąpiły wyłącznie po reakcjach RT poddanych mikromieszaniu przez 60 minut (Rysunek 2Bb, 2 czerwone linie). Wszystkie pozostałe próbki (tj. mikromieszanie przez 5 min, trituracje i kontrole negatywne) wygenerowały alternatywne produkty amplikonowe (np. dimery starterów).
Rycina 1. Schemat procedury zastosowania mikromieszania w standardowych laboratoryjnych reakcjach RT. Bardziej szczegółowe opisy zastosowanej zasady fizycznej, mikromieszacza oraz sposobu budowy własnego mikromieszacza znajdują się w literaturze. 13,14
Rycina 2.Reprezentatywne dane qPCR ilustrujące korzyści z zastosowania mikromieszania w poprzedzających reakcjach RT obejmujących ilości mRNA odpowiadające pojedynczym komórkom w standardowych laboratoryjnych reakcjach RT. A Przykładowe krzywe qPCR wykazujące obecność cDNA reprezentującego mRNA kodujące gen Nurr-1. Poprzednie reakcje RT zawierały 2,5 pg całkowitego RNA w objętości 25μL i przeprowadzono w inkubatorze w temperaturze 37°C przez 60 minut. Reakcje RT mieszano poprzez tryturację mieszaniny RT przed inkubacją (linie czarne, „trituration”), mikromieszano podczas pierwszych 5 minut reakcji RT (linie niebieskie, „micromixed5”) lub mikromieszano przez pełne 60 minut reakcji RT (linie czerwone, „micromixed60”). Poniżej przedstawiono średnie ± SEM liczby cykli qPCR wymaganych do osiągnięcia 50% maksymalnej fluorescencji dla n=3 powtórzeń tego doświadczenia. Gwiazdka oznacza różnicę istotną (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya). B Kolejny eksperyment qPCR analizujący produkt cDNA Nurr-1, tym razem po reakcjach RT zawierających 25 pg całkowitego RNA w objętości 25μLKrzywe qPCR (a) oraz analiza krzywej topnienia uzyskanych produktów qPCR (b) przedstawiono dla różnych warunków mieszania. Uwzględniono również kontrole negatywne, w których do poprzedzającej reakcji RT nie dodano cDNA (szare linie, „neg.”). Przeprowadzono również reakcje RT z znacznie wyższymi stężeniami mRNA, które dały piki krzywych topnienia (dane nieprzedstawione) identyczne z tymi w (b) dla próbek micromixed60 (ślady czerwone).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda zastosowania mikromieszania w standardowych laboratoryjnych reakcjach RT może oczywiście obejmować mRNA pozyskane dowolną metodą (np. lizę komórek, laserową mikrodysekcję przechwytywaniem). Może ona również obejmować odczynniki do RT dowolnych marek lub typów, dowolną temperaturę (w granicach tolerancji materiałów mikromieszacza) oraz dowolny czas trwania. Na przykład zaobserwowaliśmy zwiększoną wydajność cDNA w reakcjach RT z zastosowaniem losowych heksamerów lub starterów oligo-dT. Metoda ta może b...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badanie to zostało sfinansowane przez National Health and Medical Research Council of Australia (grant projektowy nr 6288480) oraz Scobie and Clare MacKinnon Trust.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Całkowity RNA wyizolowano z błyskawicznie zamrożonych, świeżo przygotowanych skrawków śródmózgowia dorosłych myszy. | |||
| Zestaw do izolacji RNA PicoPure | Arcturus Bioscience | KIT0204 | Zestaw jest już dostępny w ofercie firmy Applied Biosystems |
| Odczynniki do usuwania i obróbki DNazą wolną od DNA | Ambion | AM1906M | |
| Losowe primery heksamerowe | Promega Corp. | C1181 | |
| AMV-RT | Promega Corp. | M5101 | |
| zestaw dNTP | Promega Corp. | U1240 | |
| RNazina Inhibitor rybonukleazy | Promega Corp. | N2111 | |
| Woda wolna od nukleaz | Promega Corp. | P1193 | |
| SYBR Gotowy zestaw do PCR z barwnikiem (Green PCR Master Mix) | Applied Biosystems | 4309155 | |
| Hprt forward (20-mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt rewersyjny (20-mer): TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 rewersyjny (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| Spektrofotometr NanoDrop 1000. | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Firma Corbett Life Science została przejęta przez QIAGEN w lipcu 2008 roku |
Bibliografia
- Livesey, F. J. Brief Funct Genomic Proteomic. 2 (1), 31-31 (2003).
- Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
- Ottino, J. M., Wiggins, S. Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
- Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
- Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
- Jiao, Z. J., Huang, X. Y. Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
- Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
- Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
- Autom, L. ab 11, 399-399 (2006).
- Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. 47 (4), 827-827 (2009).
- Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. 50 (2), 116-116 (2011).
- Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
- Riley, N. Ann Rev Fluid Mech. 33, 43-43 (2001).
- Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
