Ocena stanu palmitoylacji białek błony komórkowej z tkanki mózgowej myszy

Streszczenie

Źródło: Speca, D. J., et al. Test przesunięcia żelu acylo-pegylowego do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej. J. Vis. Exp. (2020).

Film przedstawia analizę stanu palmitoilacji białek błony komórkowej wyizolowanych z tkanki mózgowej myszy. Proces ten polega na wystawieniu niepalmitoilowanych cystein i zablokowaniu ich, a następnie użyciu polimeru, który wiąże się z cysteinami palmitoilowanymi, pomagając w ocenie stanu palmitoilacji wyizolowanych białek.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie błon mózgowych myszy

1. Odetnij głowę myszy za pomocą aparatu gilotynowego i szybko wypreparuj mózg (w <1 minutę, jeśli to możliwe, aby zminimalizować zmiany palmitoilacji, które mogą wystąpić podczas procedury sekcji). Natychmiast homogenizować w 10 ml buforu homogenizacyjnego (Tabela 1) w szklanym homogenizatorze (~12 suwów) na lodzie.
2. Wirować lizaty przez 15 minut w temperaturze 1 400 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki na lodzie. Zawiesić osad (~6 uderzeń) w równej objętości buforu homogenizacyjnego i odwirować przy 710 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
3. Połączyć supernatanty z kroku 1.2 i odwirować w temperaturze 40 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
4. Odrzucić supernatant (frakcję cytozolową) i ponownie zawiesić granulowaną frakcję membranową (P2) w buforze homogenizacyjnym.
   UWAGA: Próbki mogą być błyskawicznie zamrażane i przechowywane w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
5. Wykonaj test kwasu bicinchoninowego (BCA), aby określić ilościowo poziom białka. W przypadku testu wymiany żelu acylo-pegylowego (APEGS) należy rozpocząć od ~100−200 mg białka (maksymalnie 250 mg) w objętości 470 μl buforu A (Tabela 1) w probówce o pojemności 1,5 ml. Sonikować i odwirowywać w temperaturze >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego białka. Przenieś rozpuszczone białko do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.

2. Test przesunięcia żelu acylo-pegylowego (APEGS)

1. Rozbijaj wiązania dwusiarczkowe i blokuj wolne cysteiny.
   1. Rozbijać wiązania dwusiarczkowe przez inkubację w 25 mM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP; 25 μl, dodanej z roztworu podstawowego; Tabela 1) przez 60 min w temperaturze 55 °C.
   2. Blokować cysteiny wolne od 50 mM N-etylomaleimidem (NEM; 12,5 μl, dodanym z roztworu podstawowego; Tabela 1) w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
      UWAGA: Reakcja może być przedłużona z dnia na dzień.
2. Przeprowadzić wytrącanie chloroformu metanolu (CM).
   1. Przenieś roztwór białkowy z probówki o pojemności 1,5 ml do probówki z polipropylenu lub szkła, którą można odwirować w wahadłowym wirniku kubełkowym z niewielką prędkością. Idealna jest tubka o pojemności 5 ml. Dodać cztery objętości (2 ml) metanolu (MeOH) i krótko odmieszać.
   2. Dodać dwie objętości (1 ml) chloroformu i krótko przemieszać.
   3. Dodaj trzy objętości (1,5 ml) wody dejonizowanej (dH₂O) i krótko zmieszaj.
   4. Odwirować próbki o sile 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C w obracającym się wirniku kubełkowym.
   5. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć górną fazę.
   6. Dodaj 3 objętości (1,5 ml) MeOH i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj, uważając, aby nie rozdrobnić nieprzezroczystego naleśnika białkowego.
   7. Wirować przy 3,000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w wahadłowym wirniku kubełkowym.
   8. Za pomocą szklanej pipety serologicznej usuń jak najwięcej górnej fazy, nie naruszając naleśnika białkowego.
   9. Ostrożnie spłucz osad 1 ml MeOH.
   10. Suszyć pelety na powietrzu przez co najmniej 10 minut.
       UWAGA: Suszony granulat można przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Wykonać rozszczepienie wiązań palmitoilowo-tioestrowych za pomocą hydroksyloaminy (NH₂OH, SZYNKA).
   1. Zawiesić osad białkowy w 125 μl buforu A i krótko wykonać sonikację. Wirować w temperaturze >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Przenieś rozpuszczone białko do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
   2. Dodać 375 μl buforu H (HAM+; Tabela 1) lub bufor T (HAM-; Tabela 1) i inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze 25 °C.
4. Powtórzyć wytrącanie CM opisane w kroku 2.2.
   UWAGA: Suszone granulki można przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Dodaj mPEG do niezabezpieczonych cystein.
   1. Zawiesić osad w 100 μl buforu A zawierającego 10 mM TCEP. Przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: To normalne, że znaczna utrata białka nastąpiła podczas etapów wytrącania CM. Wszystkie kolejne kroki będą wykonywane w probówce o pojemności 1,5 ml, ograniczając objętość białka do maksymalnie ~120−130 μL. Zmniejszy to utratę białka podczas końcowego wytrącania CM.
   2. Dodać 20 mM mPEG-5k (25 μl, dodać z roztworu podstawowego; Tabela 1) do próbki białka i wymieszać pipetując. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 25 °C z obrotem od końca do końca.
   3. Aby usunąć nieinkorporowany mPEG-5k, należy przeprowadzić wytrącanie CM zgodnie z opisem w kroku 2.2, używając następujących dostosowanych objętości: 4 objętości MeOH (500 μL), 2 objętości chloroformu (250 μL) i 3 objętości dH₂O (375 μL). Wirować w temperaturze >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
   4. Ostrożnie usuń górną fazę jak poprzednio, unikając grubego, kłaczkowatego naleśnika. Dodaj 1 ml MeOH i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj. Wirować w temperaturze >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
   5. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i przepłukać osad 1 ml MeOH. Wirować w temperaturze >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C. Suchy na powietrzu granulat.
      UWAGA: Suszony pellet można przechowywać w temperaturze -20 °C.
   6. Zawiesić wysuszony osad w 50 μl buforu A (bez TCEP lub jakiegokolwiek środka redukującego).

Wyniki

Tabela 1: Roztwory używane do testu APEGS. Bufor homogenizacyjny i bufor A można przygotować z wyprzedzeniem; jednak bezpośrednio przed użyciem należy dodać inhibitory proteazy i fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF). Wszystkie inne roztwory należy przygotować na świeżo.

Bufor

Komponenty

Działająca konc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hydroksyloamina (szynka)	ThermoFisher	26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)	NOF	ME-050MA	MW ~5000 kDa
Mikrofuge	Eppendorf	5415R	lub równoważny sprzęt
N-etylomalemid (NEM)	Calbiochem	34115	Wysoce toksyczny
Kamera optyczna do densytometrii	Azure Biosystems	Szafirowy obrazownik biomolekularny	lub równoważny sprzęt
Rurki polipropylenowe z nakrętką	Fisher Naukowy	14-956-1D
Pipety serologiczne (szklane)	Fisher Scientific	13-678-27D
Wirówka stołowa	Beckman	Allegra X-15R	lub równoważny sprzęt
Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)	EMD Millipore	580560