$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie błon mózgowych myszy
- Odetnij głowę myszy za pomocą aparatu gilotynowego i szybko wypreparuj mózg (w <1 minutę, jeśli to możliwe, aby zminimalizować zmiany palmitoilacji, które mogą wystąpić podczas procedury sekcji). Natychmiast homogenizować w 10 ml buforu homogenizacyjnego (Tabela 1) w szklanym homogenizatorze (~12 suwów) na lodzie.
- Wirować lizaty przez 15 minut w temperaturze 1 400 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki na lodzie. Zawiesić osad (~6 uderzeń) w równej objętości buforu homogenizacyjnego i odwirować przy 710 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Połączyć supernatanty z kroku 1.2 i odwirować w temperaturze 40 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant (frakcję cytozolową) i ponownie zawiesić granulowaną frakcję membranową (P2) w buforze homogenizacyjnym.
UWAGA: Próbki mogą być błyskawicznie zamrażane i przechowywane w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
- Wykonaj test kwasu bicinchoninowego (BCA), aby określić ilościowo poziom białka. W przypadku testu wymiany żelu acylo-pegylowego (APEGS) należy rozpocząć od ~100−200 mg białka (maksymalnie 250 mg) w objętości 470 μl buforu A (Tabela 1) w probówce o pojemności 1,5 ml. Sonikować i odwirowywać w temperaturze >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego białka. Przenieś rozpuszczone białko do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
2. Test przesunięcia żelu acylo-pegylowego (APEGS)
- Rozbijaj wiązania dwusiarczkowe i blokuj wolne cysteiny.
- Rozbijać wiązania dwusiarczkowe przez inkubację w 25 mM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP; 25 μl, dodanej z roztworu podstawowego; Tabela 1) przez 60 min w temperaturze 55 °C.
- Blokować cysteiny wolne od 50 mM N-etylomaleimidem (NEM; 12,5 μl, dodanym z roztworu podstawowego; Tabela 1) w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
UWAGA: Reakcja może być przedłużona z dnia na dzień.
- Przeprowadzić wytrącanie chloroformu metanolu (CM).
- Przenieś roztwór białkowy z probówki o pojemności 1,5 ml do probówki z polipropylenu lub szkła, którą można odwirować w wahadłowym wirniku kubełkowym z niewielką prędkością. Idealna jest tubka o pojemności 5 ml. Dodać cztery objętości (2 ml) metanolu (MeOH) i krótko odmieszać.
- Dodać dwie objętości (1 ml) chloroformu i krótko przemieszać.
- Dodaj trzy objętości (1,5 ml) wody dejonizowanej (dH2O) i krótko zmieszaj.
- Odwirować próbki o sile 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C w obracającym się wirniku kubełkowym.
- Ostrożnie wyjmij i wyrzuć górną fazę.
- Dodaj 3 objętości (1,5 ml) MeOH i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj, uważając, aby nie rozdrobnić nieprzezroczystego naleśnika białkowego.
- Wirować przy 3,000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w wahadłowym wirniku kubełkowym.
- Za pomocą szklanej pipety serologicznej usuń jak najwięcej górnej fazy, nie naruszając naleśnika białkowego.
- Ostrożnie spłucz osad 1 ml MeOH.
- Suszyć pelety na powietrzu przez co najmniej 10 minut.
UWAGA: Suszony granulat można przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Wykonać rozszczepienie wiązań palmitoilowo-tioestrowych za pomocą hydroksyloaminy (NH2OH, SZYNKA).
- Zawiesić osad białkowy w 125 μl buforu A i krótko wykonać sonikację. Wirować w temperaturze >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Przenieś rozpuszczone białko do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
- Dodać 375 μl buforu H (HAM+; Tabela 1) lub bufor T (HAM-; Tabela 1) i inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze 25 °C.
- Powtórzyć wytrącanie CM opisane w kroku 2.2.
UWAGA: Suszone granulki można przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Dodaj mPEG do niezabezpieczonych cystein.
- Zawiesić osad w 100 μl buforu A zawierającego 10 mM TCEP. Przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
UWAGA: To normalne, że znaczna utrata białka nastąpiła podczas etapów wytrącania CM. Wszystkie kolejne kroki będą wykonywane w probówce o pojemności 1,5 ml, ograniczając objętość białka do maksymalnie ~120−130 μL. Zmniejszy to utratę białka podczas końcowego wytrącania CM.
- Dodać 20 mM mPEG-5k (25 μl, dodać z roztworu podstawowego; Tabela 1) do próbki białka i wymieszać pipetując. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 25 °C z obrotem od końca do końca.
- Aby usunąć nieinkorporowany mPEG-5k, należy przeprowadzić wytrącanie CM zgodnie z opisem w kroku 2.2, używając następujących dostosowanych objętości: 4 objętości MeOH (500 μL), 2 objętości chloroformu (250 μL) i 3 objętości dH2O (375 μL). Wirować w temperaturze >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
- Ostrożnie usuń górną fazę jak poprzednio, unikając grubego, kłaczkowatego naleśnika. Dodaj 1 ml MeOH i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj. Wirować w temperaturze >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
- Ostrożnie usunąć sklarowany osad i przepłukać osad 1 ml MeOH. Wirować w temperaturze >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C. Suchy na powietrzu granulat.
UWAGA: Suszony pellet można przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Zawiesić wysuszony osad w 50 μl buforu A (bez TCEP lub jakiegokolwiek środka redukującego).