Wytwarzanie mikrogranulek polimerowych uwalniających beta-amyloid do modelowania choroby Alzheimera

Streszczenie

Źródło: Almari, B., i wsp. Wytwarzanie mikrogranulek alginianowych wydzielających amyloid β do użytku w modelowaniu choroby Alzheimera. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje metodę wytwarzania mikrogranulek polimerowych, które otaczają neurotoksyczne komórki wydzielające beta-amyloid. Zawiesina komórka-polimer jest przetwarzana przez urządzenie do wytwarzania mikrogranulek, przy czym żelowanie polimeru uzyskuje się poprzez sieciowanie wapnia, tworząc kuliste mikrokulki wokół komórek. Polimer umożliwia proliferację komórek, umożliwiając jednocześnie kontrolowane, długotrwałe uwalnianie beta-amyloidu, symulując jego akumulację w chorobie Alzheimera.

Protokół

1. Przygotowania

1. Przygotować 100 ml ~4% (w/v) roztworu podstawowego alginianu.
   1. Odważyć 4,4 g soli sodowej alginianu i dodać suchy proszek do 100 ml soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (HBS, 20 mM kwasu hydroksyetylopiperazyno-etanosulfonowego [HEPES] (0,477 g) z 150 mM NaCl (0,877 g) w wodzie dejonizowanej, umożliwiając nawodnienie.
   2. Użyj mieszadła magnetycznego z prędkością ~500 obrotów na minutę (rpm) i podgrzej do 50 °C, aby umożliwić pełne uwodnienie alginianu.
      nuta: Alginian może potrzebować jednej lub dwóch godzin, aby być całkowicie nawodnionym. Aby zaoszczędzić czas, roztwór alginianu można przygotować dzień przed protokołem enkapsulacji i przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego dnia. Gdy alginian jest przechowywany w lodówce, delikatnie podgrzać do temperatury 37 °C za pomocą łaźni wodnej lub płyty grzejnej i wymieszać mieszadłem magnetycznym bezpośrednio przed użyciem.
   3. Przed użyciem sterylnie przefiltrować roztwór alginianu za pomocą filtra polieterosulfonowego (PES) o porach 0,22 μm. Zaleca się filtrowanie w temperaturze 37 °C, aby umożliwić łatwy przepływ alginianu. Lepkość wzrośnie, jeśli temperatura spadnie.
2. Przygotować 1,000 ml 0,5 M CaCl₂.
   1. Odważyć 55,49 g bezwodnego CaCl₂ i rozpuścić w 1 000 ml HBS (20 mM HEPES i 150 mM NaCl w 1 000 ml wody dejonizowanej).
   2. Sterylny filtr wykorzystujący filtr PES o porach 0,22 μm.
3. Przygotować 100 ml mieszaniny do rozpuszczania.
   1. Przygotować 100 mM roztworu HEPES (23,83 g) i 500 mM dwuwodnego cytrynianu trisodowego (147,05 g) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami.
   2. Dostosuj do pH 7,4 za pomocą NaOH lub HCl.

2. Konfiguracja systemu enkapsulacji

1. Wyczyść okap z przepływem laminarnym.
   1. Wysterylizuj okap z przepływem laminarnym zawierający enkapsulator za pomocą ekspozycji na promieniowanie UV, a następnie spryskaj 70% v/v roztworem etanolu.
   2. Przepłucz system enkapsulacyjny 10 ml 70% roztworu etanolu v/v, a następnie 10 ml sterylnej wody dejonizowanej.
   3. Zamocuj dyszę 300 μm i powtórz krok 2.1.2.
   4. Spryskać butelkę zawierającą przefiltrowany roztwór alginianu, butelkę zawierającą przefiltrowany roztwór chlorku wapnia oraz wszelkie narzędzia, sprzęt i puste płytki hodowlane, które będą używane, roztworem etanolu o stężeniu 70% v/v i umieścić je w okapie z przepływem laminarnym. Przed użyciem ponownie włącz lampę UV na 30 minut, aby dokładnie wysterylizować.
   5. Przygotować zlewkę na odpady wypełnioną biologicznym roztworem dezynfekującym i umieścić zlewkę w pokrywie.
   6. Napełnij zlewkę 100 ml sterylnego roztworu CaCl₂ (wodnego) i dodaj mieszadło magnetyczne. Ustaw prędkość mieszania na 100 obr./min. Umieść zlewkę na platformie magnetycznej na wysokości 18 cm od końcówki dyszy. Ta zlewka będzie używana do zbierania kulek alginianowych i umożliwienia ich żelowania.
2. Przygotuj komórki do enkapsulacji.
   1. Usunąć komórki z inkubatora i odłączyć od kolby prawie zlewającej się za pomocą 0,25% roztworu kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
   2. Wyizolować próbkę w celu oszacowania gęstości komórek, a następnie odwirować pozostałe komórki z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.
   3. Ponownie zawiesić osad w HBS (20 mM HEPES i 150 mM NaCl), aby podwoić końcowe pożądane stężenie komórek (np. dla końcowego stężenia 1,5 x 10⁶ komórek/ml, ponownie zawiesić komórki w HBS, aby osiągnąć stężenie 3 x 10⁶ komórek/ml).
   4. W probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wymieszaj zawiesinę komórek w stosunku 1:1 z ~4% (m/v) roztworem alginianu, aby uzyskać końcową zawiesinę zawierającą pożądane stężenie komórek (np. 1,5 x 10⁶ komórek/ml) w ~2% (m/v) roztworze alginianu.
3. Ustaw parametry hermetyzacji.
   1. Ustaw prędkość maszyny do enkapsulacji na maksymalną prędkość wytłaczania (8,9 ml/min), napięcie na 1,0 kV, a częstotliwość na 5,500 Hz.
      nuta: Parametry te zostały wcześniej zoptymalizowane w celu uzyskania mikrokulek o średnicy 550 μm.

3. Produkcja

1. Wytwarzaj mikrogranulki.
   1. Do strzykawki o pojemności 20 ml należy wlać 5 ml zawiesiny alginianu komórkowego i podłączyć strzykawkę do kapsułki.
   2. Uruchom enkapsulator, aktywując przepływ, który przepchnie zawiesinę alginianu komórkowego przez podajnik. Strumień kropel zostanie wytłoczony przez dyszę.
   3. Zebrać pierwszy 1 ml do zlewki na odpady, aby uniknąć początkowego niejednorodnego strumienia.
   4. Kontynuuj przepuszczanie pozostałych 4 ml, pozwalając, aby kropelki wpadły do kąpieli żelującej CaCl₂. Każdy mililitr może być uruchamiany osobno (ale kolejno) i w razie potrzeby zbierany w czterech różnych kąpielach żelujących.
      nuta: W kontakcie z kąpielą żelacyjną alginian w kropelkach natychmiast sieciuje się z jonami wapnia w kąpieli żelowej i tworzy kuliste mikrokulki.
   5. Po jednej minucie wyjmij zlewkę żelującą z platformy magnetycznej i pozostaw mikrogranulki na kolejne 4 minuty bez mieszania (czas niezbędny do całkowitego przeżelowania mikrokulek w temperaturze pokojowej).
2. Odzyskaj mikrogranulki.
   1. Usuń wszelkie duże zanieczyszczenia lub artefakty alginianowe za pomocą sterylnej pęsety, a następnie użyj sterylnej plastikowej pipety, aby przenieść do filtra siatkowego 74 μm w celu pobrania mikrogranulek z kąpieli żelującej.
   2. Przenieść mikrogranulki do probówki wirówkowej przy użyciu odpowiedniej pożywki hodowlanej i pozostawić je do równowagi przez 5 minut w pożywce do hodowli komórkowej.
   3. Przenieść do kolby, płytki lub płytki Petriego w celu inkubacji i dalszych doświadczeń.
      nuta: Kąpiel żelująca nie powinna być ponownie używana.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.22 um filtr PES	Merck, Wielka Brytania	SLGP033RS
Filtr siatkowy Netwell 15mm insert 74 um	Constar, stany zjednoczone	#3477
Kwas alginowy sól sodowa z alg brunatnych	Sigma-Aldrich,uk	A0682
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich,uk	C1016
Test proliferacji komórek CellTiter96 AQueous One Solution	Promega, Stany Zjednoczone	G3580
Enkapsulator	Inotech	IE-50	nr seryjny 05.002.01-2005
HEPES	Sigma-Aldrich,uk	H4024
Solanka buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich,uk	D1408
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich,uk	433209
Cytrynian trispdium dwuwodny	Sigma-Aldrich,uk	W302600-K
Roztwór trypsyny-EDTA	Sigma-Aldrich,uk	T4049