$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz przegląd weterynaryjny JoVE
Uwaga: Zacznij od zidentyfikowania docelowej populacji myszy. We wcześniejszych badaniach wykorzystano tylko samce myszy C57 / Bl6 typu dzikiego. Jednak można również użyć różnych myszy transgenicznych lub nokautujących. Należy pamiętać, że współrzędne stereotaktyczne są oparte na anatomii C57/Bl6. Zaleca się, aby każdy użytkownik wstępnie zweryfikował lokalizację udaru w istocie białej.
1. Indukcja udaru istoty białej - podejście przyśrodkowe pod kątem
- Zacznij od przygotowania wyciągniętej szklanej pipety za pomocą rurki kapilarnej 0,5 mm o średnicy dystalnej między 15-25 μm.
- Przygotować sterylną 10 μl podwielokrotności chlorowodorku L-Nio (N(5)-(1)-iminoetylo-L-ornityny) w stężeniu 27,4 mg/ml (130 μM) w sterylnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej.
- Wstępnie napełnij pipetę z wyciągniętego szkła niewielką objętością L-Nio (2-5 μl), umieszczając szklaną pipetę na rurce podłączonej do przewodu próżniowego. Połóż pipetę płasko na blacie stołu i włóż wyciągniętą końcówkę do roztworu L-Nio.
- Stosować próżnię, aż co najmniej 2 mm z 0,5 mm części pipety zostanie napełnione. Wyłącz próżnię i wyjmij pipetę. Odłóż go na bok do kroku 1.12.
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie myszy za pomocą standardowego 32% izofluranu przepływającego przez parownik (5 l/min wdychany z 5 l/min tlenu i 0,5 l/min azotu) przez 1 minutę lub do momentu głębokiego znieczulenia. Przenieś mysz do aparatu stereotaktycznego wyposażonego w mikroskop stereotaktyczny. Zapewnij znieczulenie podtrzymujące za pomocą 32% izofluranu przepuszczonego przez parownik (2 l/min wdychane z 5 l/min tlenu i 0,5 l/min azotu) i stożkiem nosowym. Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi.
- Ustawić ramię wtryskowe w pozycji 36°.
- Przymocuj wyciągnięty szklany uchwyt do pipet na dystalnym końcu systemu iniekcyjnego o niskiej objętości i przymocuj go do ramienia iniekcyjnego zestawu stereotaktycznego.
- Posmaruj wąsy znieczulonego zwierzęcia wazeliną i nałóż sztuczną maść na łzy na oba oczy. Przygotuj sterylne pole operacyjne, umieszczając sterylną serwetę na głowie zwierzęcia z otworem 5-10 cm nad głową. Przygotuj aseptyczną powierzchnię chirurgiczną, goląc futro pokrywające czaszkę. Oczyść skórę głowy naprzemiennie betadyną i wacikami nasączonymi 70% alkoholem.
- Wykonaj 1,5 cm nacięcie skóry głowy w linii środkowej sterylnymi cienkimi nożyczkami, aby odsłonić powierzchnię czaszki. Osusz czaszkę sterylnym wacikiem i za pomocą mikroskopu stereotaktycznego przy powiększeniu 1-3X usuń wszelkie leżące nad nią tkanki okostnej za pomocą sterylnego narzędzia do mikropunktu.
- Oznacz Bregmę jako punkt odniesienia za pomocą cienkiego markera.
- Wywierć eliptyczną kraniotomię o średnicy 2 mm za pomocą sterylnego wiertła chirurgicznego z drobną końcówką, zaczynając od tyłu od Bregmy i rozciągając się do przodu tuż po lewej stronie linii środkowej. Usuń fragmenty kości i leżące nad nimi tkanki miękkie, aby można było uwidocznić korę mózgową.
- Utrzymuj wilgotne pole operacyjne i powierzchnię kory mózgowej, sporadycznie aplikując krople sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
- Przymocować wyciągniętą szklaną pipetę do ramienia wtryskiwacza aparatu stereotaktycznego. Wyrównaj dystalny koniec pipety z Bregma i wyzeruj współrzędne stereotaktyczne.
- Przesuń pipetę do pierwszej współrzędnej przedniej/tylnej (A/P) i przyśrodkowej/bocznej (M/L) podanych w Tabela 1.
- Przyłożyć pipetę do powierzchni kory mózgowej i wyzerować pomiar grzbietowy/brzuszny (D/V).
- Powoli wprowadzaj pipetę do mózgu, aż osiągniesz pierwszą współrzędną D/V w Tabeli 1.
- Korzystając z systemu iniekcyjnego o niskim ciśnieniu ustawionym na 20 psi dla impulsów 20 ms, wstrzyknij 100 nl L-Nio do mózgu i odczekaj 5 minut, aby zapobiec refluksowi w górę ścieżki pipety.
- Użyj skalibrowanej siatki celowniczej w okularze mikroskopu stereotaktycznego i powiększenia 3X.
- W związku z tym należy przesunąć łącznie 0,100 mm3 (0,5 mm długości w pipecie o średnicy 0,5 mm, co odpowiada 100 nl) od wyciągniętej szklanej pipety dla każdego zestawu współrzędnych. Używając siatki, mierz i standaryzuj, ponieważ każda konfiguracja różni się w zależności od użytego powiększenia i skali.
- W celu dokładnego pomiaru objętości podczas każdego wstrzyknięcia, należy zbliżyć się do ustawionej pod kątem pipety z mikroskopem z boku, tak aby menisk powietrzno-płynny miał widok strzałkowy. Menisk powinien znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej zarówno wewnętrznej, jak i zewnętrznej ścianki pipety.
- Powoli wyjmij pipetę i powtórz kroki 1.13-1.16.3 dla drugiego i trzeciego zestawu współrzędnych podanych w Tabela 1.
- Po ostatnim wstrzyknięciu należy wyjąć pipetę i umieścić wystarczającą ilość wosku kostnego, aby wypełnić miejsce kraniotomii. Przybliż krawędzie rany skóry głowy i zwiąż za pomocą kleju skórnego.
- Wstrzyknąć 0,1 ml 0,5% Marcaine w brzegi rany za pomocą sterylnej igły 30 G, aby zapobiec miejscowemu bólowi związanemu z nacięciem skóry głowy.
- Zwierzę należy umieścić w pomieszczeniu i podawać antybiotyki pooperacyjne (0,48 mg/ml trimetoprimu-sulfametoksazolu lub 0,5 mg/ml lewofloksacyny) w wodzie do picia przez 5 dni.
