Wykrywanie interakcji białko-białko u larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Streszczenie

Źródło: Wang, S., et al. Wykrywanie in situ kompleksów białkowo-białkowych w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film przedstawia wizualizację interakcji białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ) przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Po wyizolowaniu ścian ciała, oddziałujące białka są badane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z PLA. Bliskość oddziałujących białek ułatwia ligację sond z oligonukleotydami konektorowymi, tworzącymi koliste DNA, które jest następnie amplifikowane przez amplifikację toczącego się koła. Sondy fluorescencyjne wiążą się ze amplifikowanym DNA, umożliwiając wizualizację interakcji białko-białko w NMJ.

Protokół

1. Przygotowanie ściany ciała

UWAGA: Przygotowanie ścian ciała larw trzeciego stadium rozwojowego (do badania NMJ, które unerwiają mięśnie ściany ciała) zostało przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem, ale z pewnymi modyfikacjami.

1. Rozwarstwienie
   1. Hodować stada much i krzyżówki w temperaturze 25 °C przez pięć do sześciu dni przy użyciu standardowych procedur.
   2. Zbieraj pełzające larwy trzeciego stadium z fiolek lub butelek za pomocą drobnych kleszczy.
   3. Umyj larwy na małej szalce Petriego zawierającej sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), aby usunąć wszelkie cząstki jedzenia.
   4. Umieść pojedynczą larwę na krążku sylgardowym i zanurz ją w kilku kroplach lodowatego PBS. Użycie lodowatego PBS pomoże ogłuszyć larwę, ułatwiając manipulowanie. Podczas sekcji należy upewnić się, że preparat jest zawsze zanurzony w PBS, aby zapobiec jego wyschnięciu.
   5. Ustaw larwę grzbietową stroną skierowaną do góry, tak aby dwa drogi tchawicy były widoczne pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 1A). Używając kleszczy do uchwycenia maleńkiej szpilki, przygwoźdź larwę do tylnego końca w pobliżu przetchlinków (Rysunek 1B). Kolejną szpilką przebij naskórek na przednim końcu w pobliżu haczyków ustnych. Delikatnie rozciągnij larwę wzdłuż, a następnie przygwoźdź ją (Rysunek 1B).
   6. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji ściśnij tylny koniec w pobliżu szpilki, aby utworzyć mały otwór. Nacięcie powinno być na tyle powierzchowne, aby przechodziło tylko przez naskórek.
   7. Umieszczając końcówkę dolnego ostrza nożyczek w nacięciu, przeciąć na całej długości grzbietowej linii środkowej między dwoma drogami tchawicy (Rysunek 1C). Podczas cięcia skieruj ostrza nożyczek lekko do góry, aby uniknąć uszkodzenia mięśni brzusznej ściany ciała.
   8. Wykonaj małe poziome nacięcie nieco przed umieszczoną z tyłu szpilką (Rysunek 1C). Wykonaj kolejne podobne nacięcie nieco z tyłu od umieszczonej z przodu szpilki (Rysunek 1C). Nacięcia powinny po prostu przechodzić przez naskórek.
      UWAGA: Trzy nacięcia z kroków 1.1.7 i 1.1.8 połączone powinny przypominać "" po zakończeniu, , tj. , powinna powstać lewa i prawa klapa po grzbietowej stronie ciała larwy.
   9. Ostrożnie oczyść narządy wewnętrzne kleszczami. Dodanie kilku mocnych kropli PBS pomoże przemieścić narządy z ciała larw, ułatwiając w ten sposób ich usunięcie. Unikaj szturchania ciała larwy, ponieważ spowoduje to uszkodzenie mięśni ściany ciała.
   10. Rozwiń ciało larwy i przygnij rogi w dół (Rysunek 1D). Podczas przypinania rozciągaj ścianę ciała zarówno w poziomie, jak i w pionie, aby utworzyć równomiernie napięty prostokąt (patrz Rysunek 1G dla kształtu), uważając, aby nie rozerwać mięśni ściany ciała w tym procesie.
   11. Zakończ usuwanie pozostałych narządów wewnętrznych (Rysunek 1E).
2. Utrwalenie i przepuszczalność
   1. Zanurz przypięte ścianki ciała w kilku kroplach roztworu Bouina. Inkubować przez 15 minut na lodzie. Alternatywnie użyj 4% paraformaldehydu (PFA) jako alternatywnego utrwalacza; inkubować przez 30 minut.
   2. Spłukać trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym z trytonem (PBT).
   3. Za pomocą drobnych kleszczyków ostrożnie wyjmij szpilki i przenieś ścianki korpusu za rogi do silikonowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,65 ml.
   4. Przechowuj ścianki korpusu w PBT w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do użycia z PLA. Aby uzyskać optymalne wyniki, rozpocznij barwienie immunologiczne ścian ciała w ciągu jednego lub dwóch dni od rozwarstwienia.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić na odczynnikach i zapewnić, że wszystkie ściany ciała są traktowane jednakowo podczas testu, różne genotypy można umieścić w jednej probówce. Genotypy można rozróżnić, inaczej przecinając rogi ścianek ciała (patrz na przykład Rysunek 1F).

2. Immunohistochemia

UWAGA: Barwienie immunologiczne ścian ciała larw w trzecim stadium rozwojowym przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem, ale z pewnymi modyfikacjami.
UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej i delikatnie mieszając, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Blokowanie
   1. Umyj ściany karoserii PBT trzy razy przez 10 minut każda.
   2. Blok z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę.
2. Barwienie immunologiczne
   1. Inkubować ściany ciała z pierwszorzędowymi przeciwciałami myszy i królika przeciwko dwóm białkom będącym przedmiotem zainteresowania (rozcieńczonym w 1% BSA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. W tym przypadku użyj mysiego anty-Dlg 1:10 (Dlg = duże dyski) i 1:250 królika anty-HtsM (HtsM: Hu-li tai shao mutant). Można również uwzględnić przeciwciała przeciwko markerom, które nie są wytwarzane u myszy lub królika - e.g., użyj 1:200 koziego anty-Hrp (Hrp = peroksydaza chrzanowa) do wyznaczenia błon neuronalnych.
   2. Umyć PBT trzy razy po 10 minut.
   3. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem w celu wykrycia markerów (rozcieńczonych w 1% BSA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Ponieważ sygnał PLA jest później wizualizowany za pomocą czerwonego fluoroforu, do wykrycia markera należy użyć innego fluoroforu - e.g., użyj 1:200 Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) sprzężony z anty-kozą, aby wykryć kozie przeciwciało anty-Hrp. Ze względu na stosowanie odczynników światłoczułych, od tego momentu probówki należy przechowywać w ciemności.
      UWAGA: Zestaw, który jest używany, pozwala na wykonanie PLA między pierwotnymi przeciwciałami wyhodowanymi u myszy i królika, z sygnałem wizualizowanym na czerwonym kanale pod mikroskopią konfokalną. W razie potrzeby dostępne są inne zestawy, które pozwalają na wykonanie testu z pierwszorzędowymi przeciwciałami wyhodowanymi u innych gatunków, a sygnał jest wizualizowany na innych kanałach.

3. Test ligacji zbliżeniowej

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej i delikatnie mieszając, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Sondy PLA
   1. Umyj ściany karoserii PBT trzy razy przez 10 minut każda.
   2. Inkubować za pomocą sond PLA (rozcieńczenie 1:5 każda w 1% masy ciała) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. W takim przypadku należy użyć 40 μl sondy PLA anty-mysiej MINUS, 40 μl sondy PLA anty-króliczej PLUS i 120 μl 1% BSA, aby zapewnić prawidłowe zanurzenie i wymieszanie 5-10 ścianek ciała. Rozcieńczenie sond PLA do 1:25 może nadal skutkować odpowiednim stosunkiem sygnału do szumu (i.e., dla tego eksperymentu).
2. Ligacji
   1. Umyj ściany korpusu buforem A do mycia dwukrotnie przez 5 minut każda.
   2. Inkubować z roztworem do ligacji (rozcieńczenie ligazy w buforze ligacyjnym w stosunku 1:40) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. W takim przypadku należy użyć 5 μl ligazy, 40 μl buforu 5 ligacji i 155 μl wody o wysokiej czystości, aby zapewnić prawidłowe zanurzenie i wymieszanie 5-10 ścianek ciała.
3. Wzmocnienie
   1. Umyj ściany korpusu buforem A do mycia dwukrotnie przez 2 minuty każda.
   2. Inkubować z roztworem do amplifikacji (rozcieńczenie polimerazy w buforze amplifikacyjnym w stosunku 1:80) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. W takim przypadku należy użyć 2,5 μl polimerazy, 40 μl buforu 5 Amplifikacji i 157,5 μl wody o wysokiej czystości, aby zapewnić prawidłowe zanurzenie i wymieszanie 5-10 ścianek ciała.
4. Przygotowanie do obrazowania
   1. Umyj ściany korpusu buforem myjącym B dwa razy po 10 minut każda.
   2. Umyj 0,01x buforem do płukania B raz przez 1 min.
   3. Zrównoważyć w kilku kroplach roztworu montażowego przez co najmniej 30 minut przed montażem lub przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
   4. Za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie przenieś ściany ciała na zjeżdżalnię platformową ze skórkami skierowanymi w dół. Ustaw ściany korpusu w rzędach i w tej samej orientacji w odległości jednej lub dwóch kropli od mocowania. Na preparat nakłada szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 40 mm, uważając, aby nie powstawały pęcherzyki powietrza, a następnie uszczelnić szkiełko przezroczystym lakierem do paznokci.
   5. Przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do obrazowania konfokalnego.

Wyniki

Ryc. 1: Przygotowanie ścian ciała larw w trzecim stadium rozwojowym. (A-F) Schematyczne rysunki przedstawiające rozwarstwienie ściany ciała. (A) Umieść pojedynczą larwę na krążku sylgardowym stroną grzbietową skierowaną do góry, tak aby widoczne były dwa drogi tchawicy. (B) Przygnij larwę na przednim i tylnym końcu za pomocą maleńkich szpilek, rozciągając przy tym l...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze (drobne #5)	Almedic	A10-704
Dysk Sylgarda	Światowe Instrumenty Precyzyjne	SYLG184	Wymieszaj bazę elastomerową i utwardzacz w proporcji 10:1. Ustawiany na 30 min. Wlać do formy (np. użyć 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej). Pozostaw na utwardzenie przez co najmniej 24 godziny. Podczas preparacji przyklej się do pokrywki szalki Petriego o wymiarach 60x15 mm.
Kołki Minutien (średnica końcówki 0,0125 mm)	Narzędzia Naukowe	26002-10
Nożyczki do mikrodysekcji (ultra cienkie)	Narzędzia Nauk Ścisłych	15200-00
Zjeżdżalnie platformowe			Przyklej dwa szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22x22 mm do szkiełka mikroskopowego za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, pozostawiając między nimi odstęp <20 mm do montażu próbki.
w1118	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	3605
hts01103	Centrum Magazynowe Bloomington Drosophila	10989	Stado zostało ponownie zbalansowane za pomocą równoważnika GFP, dzięki czemu homozygotyczne mutanty mogą być wybierane na podstawie braku sygnału GFP.
1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7,0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Rozwiązanie Bouina	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (paraformaldehyd): 4% PFA w 1x PBS			PFA (nauka o anachemii - 66194-300). Zobacz doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 po instrukcje jak przygotować rozwiązanie.
1x PBT (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z trytonem): 1x PBS z 0,01% trytonem			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (albumina surowicy bydlęcej): 1% BSA w 1x PBT			BSA (Bioshop Kanada - ALB001). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
mouse anti-Dlg (Dyski duże)	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	4F3	Stosować w rozcieńczeniu 1:10 w 1% masy ciała.
królik anty-HtsM (Hu-li tai shao)			Dostarczone przez dr Lynn Cooley (Uniwersytet Yale). Stosować w rozcieńczeniu 1:250 w 1% BSA.
króliczy anty-Pak (kinaza aktywowana p21)			Dostarczone przez dr Nicholasa Hardena (Simon Fraser University). Stosować w rozcieńczeniu 1:500 w 1% BSA.
mysz anty-Wg (Bezskrzydła)	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	4D4	Stosować w rozcieńczeniu 1:5 w 1% BSA.
kozi anty-Hrp (peroksydaza chrzanowa)	Jackson ImmunoResearch	123-065-021	Stosować w rozcieńczeniu 1:200 w 1% masy ciała.
Anty-koza sprzężona z FITC osłem	Jackson ImmunoResearch	705-095-003	Stosować w rozcieńczeniu 1:200 w 1% masy ciała.
Duolink In Situ PLA Sonda anty-mysia MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Sonda anty-królik PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Odczynniki do wykrywania in situ Duolink Czerwony	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Bufor do płukania A: 0,01M Tris, 0,15M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Bufor do płukania B: 0,2 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Bufor do płukania B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink Medium do montażu in situ z DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040