Oznaczanie zdolności zatrzymywania wapnia w izolowanych mitochondriach

Streszczenie

Źródło: Li, W., et. al. Test zdolności zatrzymywania Ca2+ w mitochondriach i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film przedstawia procedurę oceny zdolności mitochondriów do zatrzymywania wapnia poprzez monitorowanie zmian fluorescencji w czasie rzeczywistym w miarę wychwytu wapnia przez mitochondria. Ten test jest przydatny do badania funkcji mitochondriów i procesów związanych z wapniem, w tym apoptozy i chorób neurodegeneracyjnych.

Protokół

1. Oznaczanie zdolności retencji mitochondriów Ca²⁺

1. Przygotować pożywkę KCl (125 mM KCl (chlorek potasu), 2 mM K₂HPO₄ (fosforan dipotasowy), 1 mM MgCl₂ (chlorek magnezu), 20 mM HEPES (kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowy), 5 mM glutaminianu, 5 mM jabłczanu i 2 μM rotenonu, pH 7,4) i dodać Ca²⁺ wiążący zielony barwnik fluorescencyjny do końcowego stężenia 0,5 μM przed eksperymentem.
2. Przenieś 1 ml izolowanych mitochondriów (0,4 mg/ml) w pożywce KCl zawierającej 0,5 μM Ca²⁺-wiążący zielony barwnik fluorescencyjny do każdej 6-dołkowej płytki.
3. Inkubować mitochondria i wiążący Ca²⁺ wiążący zielony barwnik fluorescencyjny na 6-dołkowej płytce w temperaturze pokojowej, chroniony przed światłem otoczenia przez 1 minutę. Dodać 4 μl podwielokrotności 20 mM roztworu CaCl₂ (chlorek wapnia) (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl_2, 20 mM HEPES, 5 mM glutaminianu, 5 mM jabłczanu, pH 7,4) do każdej 6-dołkowej płytki, korzystając z automatycznego ustawienia dozowania, aby wprowadzić 200 nmol Ca²⁺/mg białka mitochondrialnego.
4. Użyj spektrometru fluorescencyjnego, aby monitorować zmiany fluorescencji co 3 s przez 2 minuty przy długości fali wzbudzenia 506 nm i długości fali emisji 531 nm. Płytka wyposażona jest w wytrząsanie z prędkością 600 obr./min przez 3 s pomiędzy odczytami sterowanymi oprogramowaniem (Rysunek 1).
5. Dodać dodatkowe 4 μl podwielokrotności 20 mM roztworu CaCl₂ do każdej studzienki i monitorować zmiany fluorescencji co 3 s przez 2 min. Powtarzaj ten krok, aż fluorescencja wzrośnie z czasem.
   UWAGA: Mitochondria są prowokowane dodanym Ca²⁺ wskazanym przez zwiększoną zapisaną fluorescencję. Kiedy otwiera się mPTP (por przejściowy przepuszczalności mitochondriów), fluorescencja wzrasta z czasem.
6. Zinterpretuj całkowitą ilość Ca²⁺ dodaną do momentu otwarcia mPTP jako zdolność przechowywania Ca²⁺.

Wyniki

Rysunek 1: Ustawienia oprogramowania do testu zdolności zatrzymywania mitochondriów Ca²⁺.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zieleń wapniowa-5N	Technologie życia	c-3737	Zielony barwnik fluorescencyjny wiążący wapń
Glutaminian	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
Malate	Sigma-Aldrich	46940-U
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	457
Fosforan dipotasowy	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	V900266