$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie systemów infuzyjnych z mikropompą osmotyczną
UWAGA: Przygotuj pompę, bufor sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) i lek (roztwór białka Met-CCL5/RANTES (10 ng/ml w aCSF)) w sterylnych warunkach, używając buforów przefiltrowanych filtrami 0,2 μm i przeprowadź wszystkie procedury pod kapturem hodowlanym w rękawiczkach. Zabiegi chirurgiczne przeprowadza się w następujący sposób:
- Przygotuj pompy mikroosmotyczne na dzień przed zabiegiem: Napełnij pompę mikroosmotyczną mózgu sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły z tępą główką dostarczonych wraz z zestawem. Zanurz pompę mikroosmotyczną w CSF i umieść ją na wytrząsarce z delikatnym potrząsaniem przez noc.
UWAGA: Pompa powinna być napełniona CSF i należy unikać pęcherzyków powietrza wewnątrz pompy (Rysunek 1A).
- Przed rozpoczęciem operacji należy przygotować do eksperymentu rekombinowany roztwór białka Met-CCL5/RANTES (10 ng/ml, rozcieńczony w aCSF). Usunąć płyn płynny mózgowo-rdzeniowy z pompy i powoli napełniać pompę roztworem leku, aż do wycieku nadmiaru.
UWAGA: 15 ml roztworu aCSF lub Met-CCL5/RANTES wystarcza na 5-8 pomp.
UWAGA: Powtórz procedurę, aby upewnić się, że pompa jest całkowicie wypełniona lekiem bez pęcherzyków w środku.
- Przytnij rurki cewnika na żądaną długość i przymocuj je do tępej igły do infuzji mózgu zestawu do infuzji mózgu. Napełnij zestaw infuzyjny i probówki lekiem.
- Na koniec zmontuj i podłącz zestaw do infuzji mózgu do pompy mikroosmotycznej.
UWAGA: W rurze ani w pompie nie powinny tworzyć się pęcherzyki (Rysunek 1A).
- Zanurz cały zestaw do fuzji pompy osmotycznej i mózgu w CSF w wysterylizowanej probówce o pojemności 50 ml, aby zapobiec wysychaniu pompy. Zestaw do fuzji pompy osmotycznej z mózgiem jest teraz gotowy do użycia podczas operacji.
UWAGA: Systemy pomp mikroosmotycznych mogą być używane do długotrwałego wlewu leków. Zapewnia to bezpieczny i wygodny sposób dostarczania leku do mózgu myszy.
2. Chirurgia śródmózgowia komorowego – wszczepienie pompy mikroosmotycznej
UWAGA: Wysterylizuj środowisko chirurgiczne 75% etanolem i upewnij się, że osoby biorące udział w badaniu noszą sterylne rękawiczki i czysty fartuch laboratoryjny. Narzędzia/instrumenty chirurgiczne muszą być autoklawowane i suszone przed użyciem, a następnie sterylizowane 75% etanolem pomiędzy operacjami na myszach.
- Zważ mysz i znieczul ją za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego (IP) z ketaminą/ksylazyną (ketamina 50 mg/kg, ksylazyna 10 mg/kg).
UWAGA: Ciała myszy o masie ciała mniejszej niż 24 g nie są zalecane do operacji implantacji pompy osmotycznej.
- Zamontuj i zamocuj głowicę myszy na aparacie stereotaktycznym (Rysunek 1B).
- Użyj nożyczek chirurgicznych i szczypiec, aby rozciąć zewnętrzną skórę pokrywającą czaszkę. Użyj jodu do oczyszczenia czaszki obwodowej.
- Oddziel najbardziej zewnętrzną warstwę skóry od skóry podskórnej za pomocą pary tępych szczypiec w pobliżu szyi w celu implantacji zestawu do fuzji pompy osmotycznej i mózgu (Rysunek 1C).
- Oznaczyć punkt infuzji w odniesieniu do mapy mózgu (Rysunek 1D) za pomocą aparatu stereotaktycznego. W tym eksperymencie igła musi zostać wszczepiona w obszar komory 3rd (Bregma: 0,0 mm boczny, 1,3 mm tylny, 5,7 mm brzuszny).
- Wywierć otwór za pomocą wiertła do gwoździ wokół obszaru zaznaczonego na czaszce (Rysunek 1E).
UWAGA: Uważaj, aby nie złamać opon mózgowych i naczyń krwionośnych myszy, unikając w ten sposób przerwania mikronaczyń krwionośnych w mózgu.
- Umieść zestaw do fuzji pompy mikroosmotycznej z mózgiem zawierający CSF (jako kontrolę) lub lek (roztwór białka Met-CCL5 / RANTES) pod skórą za obszarem szyi i włóż igłę do infuzji mózgu do wywierconego otworu, aby wstrzyknąć lek do mózgu myszy (Rysunek 1E). Igła przebije opony mózgowe i dostanie się do komory. Przymocuj igłę do czaszki za pomocą żelu odczulającego powierzchnię (Rysunek 1F) i odczekaj 1-2 minuty, aż klej wyschnie. Następnie odetnij wystającą część na górze igły (Rysunek 1G-H).
- Użyj kleju do tkanek, aby zagoić ranę pooperacyjną na głowie. Nałóż 50 μl kleju na wierzch rany, ściągnij obie strony skóry do siebie i przytrzymaj przez 30 sekund, aby skóra się uszczelniła (Rysunek 1I).
UWAGA: Użyj wacika nasączonego 100% alkoholem do oczyszczenia rany po operacji i 100% penicyliny ze streptomycyną, aby zapobiec infekcji. UWAGA: Skóra myszy tworzy blizny i goi się w ciągu kilku dni po podaniu kleju chirurgicznego. Główną zaletą kleju jest uniknięcie szwów chirurgicznych, które mogą powodować podrażnienia skóry lub stany zapalne.
- Umieść mysz w czystej klatce trzymanej na ciepłym talerzu (podgrzanym do 37 °C) i poczekaj, aż mysz wyzdrowieje po działaniu znieczulającym.
UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie temperatury ciała myszy, aby zwiększyć szansę na przeżycie po operacji.
- Po tygodniowym okresie rekonwalescencji myszy będą gotowe do dalszych eksperymentów, takich jak doustny test tolerancji glukozy (OGTT) i test tolerancji insuliny (ITT).
3. Doustny test tolerancji glukozy (OGTT)
UWAGA: Wykonaj doustny test tolerancji glukozy 7 dni po infuzji aCSF i MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 μL). Utrzymuj 6-godzinny post dla myszy przed OGTT z wystarczającym dopływem wody. Trzymaj zwierzęta na tym samym stole roboczym, na którym będą wykonywane eksperymenty, aby mogły zaaklimatyzować się do środowiska i zmniejszyć stres podczas zabiegu.
- Przygotowanie roztworu glukozy: Przed przeprowadzeniem eksperymentu przygotuj roztwór glukozy, rozpuszczając 3,75 g glukozy w 15 ml destylowanego H2O.
- Ustal harmonogram rejestrowania odczytów podczas procedury eksperymentalnej (Tabela 1).
UWAGA: Ważne jest, aby ustalić harmonogram z odpowiednimi odstępami czasu między każdym badaniem krwi, aby umożliwić dokładne rejestrowanie podczas eksperymentu.
- Zważ każdą mysz po poście i oblicz odpowiednią ilość glukozy do wstrzyknięcia. Na przykład, jeśli mysz waży 30 g, ilość roztworu glukozy do podania powinna wynosić 300 μl.
- Przygotuj następujące instrumenty na stole warsztatowym:
- Glukometr (Naciśnij przycisk start, aby sprawdzić stan baterii; upewnij się, że działa przed testem.)
- Chip glukozowy
- Strzykawka insulinowa (0,3 ml strzykawki insulinowej)
- Żyletki
- Zegar
- Po ustawieniu ławki zmierz i zapisz poziom glukozy we krwi w następujący sposób: Włóż czysty i nowy chip glukozowy do glukometru i naciśnij przycisk start, aby go wyzerować.
- Podnieś mysz za kark i pogłaszcz ogon kilka razy, aby zapewnić wystarczający przepływ krwi do okolicy ogona.
- Za pomocą nowej żyletki odetnij mały kawałek ogona i wyciśnij jedną małą kroplę krwi (około 10-20 μl) do chipa glukozowego. Krew powinna wypełnić chip, aby umożliwić dokładny pomiar. Glukometr natychmiast wyświetli poziom glukozy. Jeśli urządzenie pokaże "błąd", powtórz procedurę z nowym chipem glukozowym.
UWAGA: Chip glukozowy wymaga tylko jednej kropli krwi. Gdy próbka krwi musi zostać pobrana więcej niż raz, po prostu należy wycisnąć, kilkakrotnie przesuwając palcami wzdłuż ogona myszy, trzymając koniec ogona bezpośrednio na chipie, aby pobrać krew. Nie jest konieczne obcinanie końca ogona za każdym razem podczas pobierania próbek krwi.
- Następnie nakarm myszy glukozą (0,25 g / ml) doustnie, stosując technikę gajnika żołądkowego. Ilość glukozy, która ma być podawana, powinna być obliczana za pomocą wzoru: 10X masa ciała (m.c.) μl roztworu glukozy (na przykład, jeśli mysz waży 30 g, ilość roztworu glukozy do podania wyniesie 300 μL). Uruchom minutnik natychmiast po podaniu doustnie glukozy.
- Powtórz procedurę pomiaru glukozy po 15, 30, 60, 90 i 120 min.
- Po zarejestrowaniu wszystkich odczytów poziomu glukozy wyrzuć żyletki i wiórki glukozy do pojemnika na zagrożenie biologiczne. Włóż jedzenie z powrotem do klatek dla myszy i załóż je z powrotem do pokoju dla zwierząt.
Tabela 1. Harmonogram zapisu doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT)
| # | ID myszy | Ciało | Glukoza | Start | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| | waga | μL =10xBW | time | mins | mins | mins | mins | mins |
| 1 | 501 | 25.8g | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25.3g | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
