$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie preparatów i tkanek
- Użyj szkiełek z silanem lub szkiełek z membraną z polietylenu i naftalanu etylenu (PEN).
- W celu izolacji RNA zanurz szkiełka w roztworze do odkażania RNazy, przemyj 3 razy wodą wolną od RNaz, a następnie odwodnij stopniowaną serią etanolu wolnego od RNaz i wysusz próżniowo przez 30 minut.
- Wytnij skrawki tkanki o grubości 10 μm za pomocą kriostatu i zamontuj na przygotowanych szkiełkach wolnych od RNaz. Skrawki należy przechowywać w stanie zamrożonym podczas cięcia, aby zachować jakość RNA. UWAGA: Upewnij się, że tkanka znajduje się w odległości około 4 mm od krawędzi szkiełka, ponieważ LCM nie może usunąć tkanki, która jest zbyt blisko krawędzi szkiełka. Aby usunąć tkankę z szkiełka z membraną PEN, upewnij się, że tkanka znajduje się 4 mm od lewej, górnej i dolnej strony szkiełka oraz 7 mm od prawej strony szkiełka, które są wymiarami membrany, która nie jest przymocowana do szkiełka.
- W celu wyizolowania poszczególnych populacji komórek za pomocą bezpośredniej immunohistochemii, należy przeciąć tkankę na szkiełka z preparatem silanowym lub szkiełka z membraną PEN. W celu izolacji obszarów tkanki przy użyciu technik immunohistochemicznych pośrednich, należy zamontować jeden zestaw sekcji na szkiełku przygotowawczym do immunohistochemii i naprzemiennie na szkiełku z membraną PEN i / lub szkiełku z preparatem silanu, które mają być stosowane do LCM.
2. Przygotowanie tkanek do wychwytu laserowego – szybka immunohistochemia hydroksylazy tyrozyny do bezpośredniego laserowego wychwytu komórek immunoreaktywnych
- Obciąć tkankę hydrofobowym pisakiem i pozostawić do wyschnięcia.
- Utrwalić tkankę w roztworze acetonu i metanolu (1:1) w temperaturze -20 °C przez 10 minut. UWAGA: Nasze doświadczenie pokazuje, że utrwalenie acetonu i metanolu spowodowało znacznie bardziej spójną immunohistochemię niż sam aceton lub metanol.
- Przepłukać szkiełko w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) z 1% trytonem (bez RNaz).
- Pokryj skrawki 100-200 μl PBS z 1% Tritonem z przeciwciałem przeciwko hydroksylazie tyrozynowej rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 400 U/ml RNasin. Inkubować przez 5-10 minut.
- Krótko spłukać dwukrotnie w PBS i PBS-1% Triton.
- Przykryj tkankę 100-200 μl koziej anty-króliczej IgG znakowanej Alexa Fluor 488 rozcieńczonej w stosunku 1:100 w PBS-1% Triton z 400 U/ml RNasin i 50 ng/ml DAPI. Inkubuj przez 5 minut.
- Płukać 2 razy w PBS, a następnie odwadniać przez 30 s w stopniowanej serii etanolu wolnego od RNaz (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
- Inkubować w dwóch płukaniach ksylenu przez 1 minutę, a następnie 5 minut.
- Usuń szkiełka z ksylenu bezpośrednio przed użyciem do LCM i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.