Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Streszczenie

Źródło: Wagner, K. i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL poprzez pomiar względnej fluorescencji eGFP w rabdomere.

Protokół

1. Uwagi ogólne

1. Użyj Stada Drosophila eksprymujące trwale zlokalizowane białka translokacyjne do analiz dotyczących transportu białek (np. kanał jonowy podobny do potencjału receptora przejściowego (TRPL):: wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP), Arrestin 2 (Arr2)::eGFP).
2. Z góry określ warunki ekspozycji na światło wybranych much dla podejścia eksperymentalnego.
   1. W celu przystosowania się do ciemności muchy należy przechowywać w ciemnych pudełkach przez żądany okres w temperaturze 25 °C. Aby uzyskać oświetlenie do 16 godzin w eksperymentach z translokacją (np. TRPL::eGFP wyrażający muchy), trzymaj muchy pod świetlówką w temperaturze pokojowej.
   2. Do oświetlania much kolorowym światłem użyj różnokolorowych przezroczystych plastikowych pudełek wraz ze świetlówką.

2. Mikroskopia zanurzeniowa w wodzie

1. Przygotowanie much
   1. Przygotuj przestrzeń roboczą z potrzebnym sprzętem i odczynnikami, jak pokazano na Rysunek 1. Przenieś muchy o określonym wieku i warunkach oświetlenia do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i znieczulij, inkubując je na lodzie przez 15 do 30 minut.
      UWAGA: Zabierz ze sobą 1-dniowe, przystosowane do ciemności muchy jako odniesienie. Ogólnie rzecz biorąc, muchy przystosowane do ciemności należy przenieść do lodówki z pokrywką w ciemności. Przystosowane do światła muchy mogą być przenoszone na lód w świetle pomieszczenia.
   2. Przenieś jedną znieczuloną lodem muchę głową do przodu do końcówki pipety o pojemności 200 μl i ostrożnie popchnij muchę w kierunku końcówki za pomocą sprężonego powietrza.
   3. Odetnij końcówkę pipety tuż przed głową za pomocą skalpela. Za pomocą pęsety ostrożnie odepchnij muchę kilka milimetrów od końcówki. Ponownie odetnij końcówkę pipety i popchnij muchę z powrotem w kierunku końcówki za pomocą sprężonego powietrza, tak aby tylko główka muchy wystawała z końcówki pipety.
   4. Przyklej kawałek plasteliny do szkiełka podstawowego i wciśnij w niego końcówkę pipety tak, aby lewe lub prawe oko muchy było skierowane do góry (Rysunek 2A). Tuż przed akwizycją obrazu użyj pipety laboratoryjnej, aby przykleić dużą kroplę schłodzonej wody do spodu obiektywu zanurzonego w wodzie (Rysunek 2B). Natychmiast przystąp do akwizycji obrazu, aby uzyskać najlepsze wyniki.
      UWAGA: Znaczne opóźnienie w akwizycji obrazu powoduje ponowne przebudzenie i ruchy muchy, co może prowadzić do rozmytych obrazów.
      
2. Akwizycja obrazu
   1. Ostrożnie umieść szkiełko z przygotowanym muchą na stoliku mikroskopu i wybierz obiektyw do zanurzenia w wodzie.
   2. Ręcznie opuść obiektyw zanurzenia w wodzie, aż oko muchy dotknie kropli (Rysunek 3A, B).
   3. Włącz mikroskop UV lamp i wybierz odpowiedni zestaw filtrów. Użyj okularów, aby ustawić muchę pod obiektywem i skupić mikroskop na powierzchni oka.
   4. Przełącz ścieżkę światła w kierunku kamery mikroskopu i wygeneruj obraz na żywo w odpowiednim oprogramowaniu. Ponownie ustaw ostrość kamery i oceń orientację oka, biorąc pod uwagę, że oko musi być skierowane promieniowo w stronę obiektywu mikroskopu, jak pokazano bardziej szczegółowo na Rysunek 3C-E.
   5. Użyj odpowiedniej tabeli LUT (tabeli przeglądowej) w oprogramowaniu do obrazowania, aby wykryć przesycenie (oznaczone czerwonymi pikselami).
   6. W przypadku much niepigmentowanych dostosuj czas ekspozycji tak, aby najjaśniejsze piksele znajdowały się tuż poniżej limitu nasycenia dla każdego obrazu.
   7. Nagraj obraz i zapisz go jako plik RAW, aby zarchiwizować wszystkie odpowiednie metadane nagrania. Wyeksportuj obraz w formacie .tif dla następującej kwantyfikacji.
      UWAGA: Oświetl muchy przez 5 minut czerwonym światłem (np. 630 nm) natychmiast po akwizycji obrazu, jeśli mają być używane do dalszych eksperymentów. Czerwone światło dezaktywuje kaskadę fototransdukcji, która została nadmiernie aktywowana przez intensywne światło krótkofalowe podczas akwizycji obrazu.
      
3. Analiza danych i kwantyfikacja względnej fluorescencji eGFP w rabdomorach mikrofotografii zanurzeniowych w wodzie
   1. Pobierz, zainstaluj i uruchom oprogramowanie ImageJ/Fiji.
   2. Dostosuj ustawienia ImageJ, klikając Analizuj > ustaw pomiary... i zaznacz tylko pole Średnia wartość szarości. Zaimportuj obraz .tif, klikając Plik > Otwórz... lub przeciągając i upuszczając. Wybierz reprezentatywny obszar obrazu, na którym jest wyostrzony i powiększ go do 200%-300%, naciskając jednocześnie Ctrl, i +.
   3. Wybierz narzędzie Oval i naciskając klawisz Shift , wygeneruj okrągłe zaznaczenie na obrazie, które jest znacznie mniejsze niż jedna farba fluorescencyjna. Przed zwolnieniem przycisku myszy poszukaj dokładnego rozmiaru wyświetlanego pod paskiem narzędzi w oknie głównym ImageJ. Użyj tego samego rozmiaru wyboru kołowego dla wszystkich analiz.
      UWAGA: Dokładny rozmiar okrągłego zaznaczenia w pikselach lub mikronach zależy od konkretnej konfiguracji. Użyj okręgu o średnicy około 1/3 lub 1/4 średnicy rabdomeralnej 1-dniowych, przystosowanych do ciemności much kontrolnych.
   4. Przesuń zaznaczenie okrągłe, klikając w nie myszą i przeciągając lub naciskając klawisze strzałek na klawiaturze.
   5. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji w obrębie okrągłego zaznaczenia, przesuń okrąg do pierwszego rabdomeru (r1) i kliknij na Analizuj > Zmierz lub użyj skrótu Ctrl + M. Pojawi się okno Result z wyświetloną zmierzoną wartością szarości.
   6. Kontynuować pomiary r2-r6 jako powtarzające się pomiary i pomiar sygnału tła (b). W przypadku muszek niepigmentowanych należy wykonać dodatkowe pomiary odpowiednich obszarów ciała komórki (c1-c6) (Rysunek 4).
   7. Powtórz kroki 2.3.5 i 2.3.6 dla dwóch kolejnych ommatidiów, co daje trzy powtórzenia techniczne. Zaznacz analizowaną ommatidię za pomocą narzędzia Ołówek i zapisz ten obraz do dokumentacji.
   8. Wybierz i skopiuj zmierzone wartości szarości z okna Wynik i wklej je do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszych obliczeń. Posortuj wartości intensywności fluorescencji zgodnie z ich pochodzeniem w kategoriach rabdomeru (r), ciała komórki (c) i tła (b). Obliczyć średnią intensywność z każdej kategorii (Ir, Ic, Ib).
   9. Obliczyć względną ilość eGFP obecnego w rabdomerze.
   10. Przejdź do następnego obrazu w kroku 2.3.3. Zaleca się wykorzystanie obrazów od co najmniej pięciu osobników z każdej grupy eksperymentalnej jako replik biologicznych w celu uzyskania wiarygodnego pomiaru.

Wyniki

Rysunek 1: Przestrzeń robocza mikroskopii zanurzeniowej w wodzie. Potrzebne materiały to: (A) probówka wirówkowa o pojemności 15 ml, (B) płatki lodu, (C) schłodzona woda destylowana, (...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 mL probówka wirówkowa	Greiner Bio-One	188271	Flystuff	59-172
Lampa światła zimnego (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fidżi/ImageJ	NIH
Mikroskop fluorescencyjny z lampą UV, kamerą, zestawem filtrów i oprogramowaniem (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss
Świetlówka	Osram	4050300518039.00
Pipeta laboratoryjna (20-200 μL)	Eppendorf
Slajd obiektu	Roth	656.1
Końcówki do pipet (200 μL)	Labsolute	7695844
Plastelina (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Mikroskop stereoskopowy (SMZ445)	Nikon
Mikroskop stereoskopowy z lampą UV, kamerą, zestawem filtrów i oprogramowaniem (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica