Wykrywanie modyfikacji histonów w komórkach drożdży z nadekspresją białek neurodegeneracyjnych

Streszczenie

Źródło: Bennett, S. A., i wsp., Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film przedstawia procedurę oceny modyfikacji histonów w komórkach drożdży z nadekspresją białek neurodegeneracyjnych. Etapy obejmują lizę komórek, wirowanie, elektroforezę, transfer błonowy i wykrywanie zmodyfikowanych histonów na podstawie przeciwciał.

Protokół

1. Liza komórek i western blotting w celu wykrycia modyfikacji potranslacyjnych histonów

1. Cell lysis
   1. Rozmrozić granulki komórek drożdży na lodzie i ponownie zawiesić granulki komórek w 100 μL dH₂O.
   2. Do resuspension komórek dodaj 300 μL 0,2 M NaOH i 20 μL 2-merkaptoetanolu. Zawiesić pipetując w górę i w dół.
   3. Inkubować komórki na lodzie przez 10 minut, a następnie odwirowywać przy 3,200 x g na wirówce stołowej przez 30 s w temperaturze RT. Odrzucić supernatant.
   4. Zawieś ponownie osad komórek w 100 μL 1x załadowującego barwnika i gotuj przez 10 minut na bloku grzewczym.
      UWAGA: Przepis na 6-krotne obciążenie barwnika można znaleźć w Tabeli Materiałów.
2. Elektroforeza w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylu sodu i transfer membranowy
   1. Przygotuj komorę żelową, umieszczając dwa żele w uchwycie na żel, wypełniając wewnętrzną komorę do góry buforem i wypełniając komorę zewnętrzną do znaku linii dwóch żeli.
   2. Załaduj 15 μL próbki na studzienkę do 10-dołkowego żelu poliakrylamidowego o zawartości 12%. W przypadku pasa drabinki białkowej załaduj 5 μl.
   3. Uruchom żel na około 45 minut przy napięciu 150 V, lub do momentu, gdy przód barwnika dotknie dna żelu.
   4. Podczas pracy żelu, przygotuj się do transferu membrany, mocząc płatki z włókna (po dwie na żel) w buforze transferowym (Tabela Materiałów) i mocząc membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w metanolu. Przed transferem przepłukać membranę w buforze transferowym.
      UWAGA: Membranę PVDF należy przyciąć do rozmiaru żelu i używać jednej membrany PVDF na każdy przenoszony żel.
   5. Zmontuj, na półsuchym komórce aparatu transferowego, 'kanapkę' transferową: od dolnej elektrody umieść (1) wstępnie nasączoną podkładkę z włókna, (2) wstępnie nasączoną i przepłukaną membranę PVDF, (3) żel i (4) drugą wstępnie nasączoną podkładkę z włókna.
      UWAGA: Aby uniknąć pęcherzyków powietrza w transferze 'sandwich', ' delikatnie zwiń 'kanapkę' pipetą serologiczną, aby wypchnąć bąbelki. Po umieszczeniu żelu na membranie PDVF nie należy jej przesuwać.
   6. Aby przeprowadzić transfer białka, ustaw pakiet zasilający na 150 mA na 1 godzinę (dla jednej 'kanapki').
3. Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych histonów (PTM) za pomocą przeciwciał specyficznych dla modyfikacji
   1. Usuń membranę z aparatu transferowego. Spłukać krótko dH₂O.
      1. Opcjonalnie, sprawdź transfer białek za pomocą barwnika Ponceau-S, wlewając tyle barwnika Ponceau-S, aby pokryć membranę w małym plastikowym pudełku i inkubując w temperaturze RT z delikatnym potrząsaniem przez 30−60 s. Usuń plamę Ponceau-S i spłucz dH₂O, aż plama tła zniknie, a pasma białkowe będą widoczne gołym okiem. Kontynuuj płukanie za pomocą dH₂O, aż cała plama zostanie usunięta z membrany.
   2. Zablokuj błonę, inkubując blot przez 1 godzinę w temperaturze RT z delikatnym kołysaniem w buforze blokującym tris buforowany solą fizjologiczną (TBS) (Tabela Materiałów) w małym pudełku do barwienia. Użyj wystarczającej ilości bufora blokującego, aby zakryć plamę.
      UWAGA: Uważaj, aby umieścić membranę pionowo w pudełku do barwienia, tak aby strona membrany, na której leżą białka, nie była skierowana w dół.
   3. Inkubować blot w pudełku do barwienia przez noc z przeciwciałem specyficznym dla modyfikacji histonów, reagującym w stosunku do drożdży w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć przeciwciało w buforze blokującym TBS zgodnie ze specyfikacją producenta. Uwzględnij również odpowiednią kontrolę obciążenia jądrowego, taką jak anty-całkowity H3 hodowany w innym gatunku gospodarza niż przeciwciało specyficzne dla modyfikacji. Na przykład, jeśli sondujesz H3S10ph za pomocą przeciwciała anty-H3S10ph wyhodowanego u królików, użyj przeciwciała anty-całkowitego H3 wyhodowanego u myszy jako kontroli obciążenia. W razie potrzeby powtórz to dla każdej plamy.
      UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał mogą być ponownie użyte łącznie trzy razy w ciągu miesiąca. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   4. Umyj membranę 4x w domowym TBS + 0,1% polisorbatu 20 (TBST) przez 5 minut z kołysaniem w temperaturze RT.
   5. Inkubować blot z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi w rozcieńczeniach określonych przez producenta (osła anty-królika 680 i osła anty-myszy) przez 1 godzinę w RT.
      UWAGA: Fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe muszą być chronione przed światłem zarówno podczas przechowywania, jak i użytkowania. Przeprowadzić inkubację w ciemnych plastikowych pudełkach lub przykryć folią aluminiową.
   6. Pierz membranę 4x z TBST przez 5 min i pierz z TBS przez 5 minut, kołysząc się w RT.
   7. Wizualizuj blot na fluorescencyjnym systemie obrazowania Western blot przez 2 minuty. Wizualizuj przeciwciała drugorzędowe anty-królika 680 i anty-myszy 800 odpowiednio w kanałach 800 nm i 700 nm.
      UWAGA: Repliki są przeprowadzane niezależnie, począwszy od sekcji 1. W celu właściwej interpretacji danych w tych eksperymentach konieczne jest sprawdzenie, czy odpowiedź sygnałowa przeciwciała mieści się w zakresie, w którym odpowiedź sygnałowa jest liniowa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x Running Buffer			Mieszanka: 141,65 g glicyny (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g zasady Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 g dodecylosiarczanu sodu (Sigma-Aldrich L3771) i 1 l wody dejonizowanej o pH 8,8.
12% żele poliakrylamidowe	BIO-RAD	456-1041
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Anti-acetyl-histon H3 (Lys14) Podstawowy Przeciwciało	MilliporeSigma	07-353 (nr partii 2762291)	Rozcieńczenie: 1/1000
Przeciwciało pierwotne antyacetylohistona H4 (Lys16)	Abcam	ab109463 (nr partii. GR187780)	Rozcieńczenie: 1/2000
Przeciwciało pierwotne antyacetylo-histon H4 (Lys12)<	ab46983 (nr partii. GR71882)	Rozcieńczenie: 1/5000<
Abcam	ab9049 (nr partii. GR266894, GR3236147)	Rozcieńczenie: 1/1000
Przeciwciało pierwotne anty-histonowe H3	Abcam	ab24834 (nr partii. GR236539, GR174196, GR3194335)	Kontrola obciążenia jądrowego; Rozcieńczenie: 1/2000
Przeciwciało pierwotne anty-fosfo-histonowe H2B (Thr129)	Abcam	ab188292 (nr partii. GR211874)	Rozcieńczenie: 1/1000
Przeciwciało pierwotne antyfosfo-histonu H3 (Ser10)	Abcam	ab5176 (nr partii. GR264582, GR192662, GR3217296)	Rozcieńczenie: 1/1000
BioPhotometer D30	Eppendorf	6133000010
Wirówka 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (nr części C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Rozcieńczenie: 1/5000<
LI-COR	926-68073 (nr części C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	Rozcieńczenie: 1/2500
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Bardzo gruby bibuła (bibuła filtracyjna)	BIO-RAD	1703968
Membrany transferowe Immobilon-FL	MilliporeSigma	IPFL00010
Ładowanie barwnika			Mieszanka: 1,2 g siarczanu dodecylu sodu, 6 mg błękitu bromofenolowego (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 ml glicerolu, 1,2 ml 0,5 m zasady Trizma pH 6,8, 0,93 g DL-Ditiotreitol ( Sigma-Aldrich D0632) i 2,1 ml wody dejonizowanej.
Metanol	ThermoFisher	A412-4
Pionowa komórka elektroforezy Mini-PROTEAN Tetra	BIO-RAD	1658004
pipet wielokanałowy	Eppendorf	2231300045
Woda wolna od nukleaz	Qiagen	129114
System obrazowania Odyssey Fc	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-synukleina-GFP	Prezent od A. Gitlera
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	Prezent od A. Gitlera
Poli(glikol etylenowy) (PEG)	Sigma-Aldrich	P4338	Przygotuj roztwór 50% w/v.
Ponceau S Stain	Sigma-Aldrich	P3504	Mieszanka: 0,5 g 0,1% w/w barwnika Ponceau S, 5 ml 1% v/v kwasu octowego (Sigma-Aldrich 320099) i 500 ml wody dejonizowanej.
Zasilacz PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050
Bufor ładowania dodecylosiarczanu sodu			Przechowywać w temperaturze -20 oC. 6X, Wymieszaj: 1,2 g dodecylosiarczanu sodu, 6 mg błękitu bromofenolowego, 0,93 g DL-ditiotreitolu, 2,1 ml wody dejonizowanej, 4,7 ml glicerolu i 1,2 ml 0,5 M zasady Trizma, pH 6,8.
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	221465	Przygotuj roztwór 0.2 M.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)			Mix: 100 ml 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) i 900 ml wody dejonizowanej.
TBS Blocking Buffer	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell	BIO-RAD	170-3940
Transfer Buffer			Mieszanka: 22,5 g glicyny, 4,84 g zasady Tizma, 400 ml metanolu, 1 g dodecylosiarczanu sodu i 1,6 l wody dejonizowanej.
Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)			10X, 7,6 pH, Roztwór: Wymieszaj 24 g zasady Trizma i 88 g chlorku sodu (Sigma-Aldrich S7653). Napełnij do 1 l wodą dejonizowaną.
Drożdże WT 303 S. cerevisiae	Prezent od J. Shortera

td style='szerokość:108pt;'>Abcamtd style='wysokość:46,5pt;szerokość:135pt;'>Przeciwciało pierwotne antydimetylohistonowe H3 (Lys36)td style='wysokość:77.5pt;szerokość:135pt;'>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD