$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Generowanie sferoidów guza o jednolitej wielkości
UWAGA: Komórki macierzyste są hodowane w pożywce neurobazalnej uzupełnionej suplementem B27, heparyną, czynnikiem wzrostu fibroblastów 2 (FGF-2), penicyliną i streptomycyną. Komórki te spontanicznie tworzą sferoidy w hodowli.
- Przemyć komórki nowotworowe 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować komórki z 0,5-1 ml enzymu dysocjacyjnego przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
- Przemyć 4-4,5 ml PBS i dodać 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej (kompletna pożywka nerwowo-podstawna, cNBM).
- Policzyć komórki przy użyciu techniki automatycznego liczenia z błękitem trypanowym i szkiełkiem komory do liczenia komórek.
- Aby wygenerować 100 sferoid z 104 komórek na sferoidę (zgodnie z preferowanym rozmiarem), wymieszaj 106 komórek w 8 ml NBM z 2 ml 2% metylocelulozy.
- Przenieść zawiesinę do sterylnego pojemnika systemowego i dozować 100 μl/studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej do 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
- Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%. Utworzą się sferoidy o równej wielkości i można je użyć po 3-4 dniach.
2. Eksperymenty trójwymiarowe
- Inwazja
- Przygotowanie
- Przygotuj matrycę kolagenową w probówce na lodzie z kolagenem typu I w stężeniu końcowym 1 mg/ml, 1x PBS, 0,023xVkolagen, 1 M wodorotlenek sodu i sterylny H2O. Inkubować roztwór na lodzie przez 30 minut.
- Zebrać sferoidy z płytki studzienki z okrągłym dnem do probówek o pojemności 500 μL i przemyć 2x 200 μL 1x PBS.
- Ostrożnie odpipetować sferoidy do 100 μl matrycy kolagenowej i włożyć do środka studzienki do normalnych 96-dołkowych płytek.
- Inkubować żel kolagenowy przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie dodać cNBM na wierzch żelu. Na tym etapie do pożywki można dodać inhibitory lub aktywatory (np. chlorowodór, jak pokazano na Rysunek 1B, 1C).
- Akwizycja i analiza obrazu
- Rób zdjęcia sekwencyjnie za pomocą mikroskopu wideo w trybie jasnego pola 24 godziny po inkluzji kolagenu.
- Użyj Fidżi do analizy zdjęć ręcznie lub w sposób półautomatyczny. Aby to zrobić ręcznie, narysuj wokół rdzenia i całkowitego obszaru sferoidy za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego i zmierz obszar inwazyjny każdej sferoidy, odejmując całkowitą powierzchnię od powierzchni rdzenia. Aby przeanalizować obrazy w sposób półautomatyczny, użyj makra w celu określenia obszaru inwazyjnego.
