Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)

Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Protokół

1. Generowanie sferoidów guza o jednolitej wielkości

UWAGA: Komórki macierzyste są hodowane w pożywce neurobazalnej uzupełnionej suplementem B27, heparyną, czynnikiem wzrostu fibroblastów 2 (FGF-2), penicyliną i streptomycyną. Komórki te spontanicznie tworzą sferoidy w hodowli.

Przemyć komórki nowotworowe 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować komórki z 0,5-1 ml enzymu dysocjacyjnego przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
Przemyć 4-4,5 ml PBS i dodać 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej (kompletna pożywka nerwowo-podstawna, cNBM).
Policzyć komórki przy użyciu techniki automatycznego liczenia z błękitem trypanowym i szkiełkiem komory do liczenia komórek.
Aby wygenerować 100 sferoid z 10⁴ komórek na sferoidę (zgodnie z preferowanym rozmiarem), wymieszaj 10⁶ komórek w 8 ml NBM z 2 ml 2% metylocelulozy.
Przenieść zawiesinę do sterylnego pojemnika systemowego i dozować 100 μl/studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej do 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności 95%. Utworzą się sferoidy o równej wielkości i można je użyć po 3-4 dniach.

2. Eksperymenty trójwymiarowe

Inwazja
1. Przygotowanie
  1. Przygotuj matrycę kolagenową w probówce na lodzie z kolagenem typu I w stężeniu końcowym 1 mg/ml, 1x PBS, 0,023xV_kolagen, 1 M wodorotlenek sodu i sterylny H₂O. Inkubować roztwór na lodzie przez 30 minut.
  2. Zebrać sferoidy z płytki studzienki z okrągłym dnem do probówek o pojemności 500 μL i przemyć 2x 200 μL 1x PBS.
  3. Ostrożnie odpipetować sferoidy do 100 μl matrycy kolagenowej i włożyć do środka studzienki do normalnych 96-dołkowych płytek.
  4. Inkubować żel kolagenowy przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie dodać cNBM na wierzch żelu. Na tym etapie do pożywki można dodać inhibitory lub aktywatory (np. chlorowodór, jak pokazano na Rysunek 1B, 1C).
2. Akwizycja i analiza obrazu
  1. Rób zdjęcia sekwencyjnie za pomocą mikroskopu wideo w trybie jasnego pola 24 godziny po inkluzji kolagenu.
  2. Użyj Fidżi do analizy zdjęć ręcznie lub w sposób półautomatyczny. Aby to zrobić ręcznie, narysuj wokół rdzenia i całkowitego obszaru sferoidy za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego i zmierz obszar inwazyjny każdej sferoidy, odejmując całkowitą powierzchnię od powierzchni rdzenia. Aby przeanalizować obrazy w sposób półautomatyczny, użyj makra w celu określenia obszaru inwazyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1

Ryc. 1: Sferoida glejaka P3 w testach proliferacji, inwazji lub migracji. (A) Test proliferacji. Lewy panel: Reprezentatywne zdjęcia z DMSO jako kontrolą lub z 20 μM rotenonu (inhibitor kompleksu łańcucha oddechowego I) w czasie 0 lub 72 godzin. Prawy panel: Kwantyfikacja obszaru sferoidalnego przedstawiona na obrazach jako linie przerywane. Skala = 250 μm...