Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Ekstrakcja α-synukleiny (αS) z wypreparowanych obszarów mózgu
- Proszę wyciąć cały mózg na plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm na lodzie za pomocą lupy o małej mocy (powiększenie 8X) za pomocą dwóch forcipów, których końce są trzymane razem, z wyjątkiem sekcji hipokampa. Nie należy przekraczać 10 minut, aby zachować integralność mózgu. Umieść mózg prawą stroną do góry i odzyskaj następujące obszary mózgu w tej kolejności:
- Oddziel jedną z dwóch opuszki węchowych za pomocą kleszczy umieszczonych tuż za nią. Odłącz go od mózgu, przesuwając go w dół. Powtórz tę operację dla drugiej żarówki.
- Delikatnie wciśnij kleszcze między dwie kory i przesuń je do przodu, aby ułatwić dysocjację dwóch kory. Utrzymując mózg na miejscu za pomocą jednych kleszczy, użyj drugiego, aby oddzielić korę od hipokampa.
- Umieść kleszcze 2 mm poniżej kory. Utrzymuj delikatny nacisk na kleszcze, aż górna część hipokampa będzie widoczna. Oderwij pierwszą część kory i powtórz z drugą częścią. Użyj kleszczy, aby oddzielić dwie kory, zaczynając od hipokampa i przesuwając się w kierunku przodu mózgu.
- Umieść otwarte kleszcze wokół jednego z hipokampów. Zamknij kleszcze na dnie hipokampa, a następnie delikatnie je usuń, odzyskując jak najwięcej. Powtórz procedurę dla drugiego hipokampa.
- Umieść otwarte kleszcze poniżej jednego z prążkowia i delikatnie oddziel go od mózgu. Użyj kleszczy, aby usunąć pozostałą korę z prążkowia. Powtórz tę procedurę dla drugiego prążkowia.
- Za pomocą kleszczy delikatnie obniż kontur móżdżku o 2 mm, aby ułatwić jego oddzielenie od mózgu. Umieść kleszcze tuż za móżdżkiem i usuń je, przesuwając kleszcze do przodu.
- Użyj szerokiej części kleszczy, aby podnieść śródmózgowie, aby wyraźnie zobaczyć, gdzie łączy się z pniem mózgu. Wykonaj pionowe nacięcie na skrzyżowaniu, a następnie usuń pień mózgu.
- Umieść kleszcze za śródmózgowiem, które składa się z czterech zaokrąglonych struktur. Naciąć pionowo, aż śródmózgowie zostanie całkowicie oddzielone od pozostałego mózgu.
- Przygotować homogenaty o zmiennej zawartości procentowej (waga/objętość) w buforze o wysokiej zawartości soli (HS), w zależności od liczby dostępnych tkanek: 5% homogenatu dla masy od 10 do 30 mg, 10% dla masy od 30 do 80 mg i 20% dla masy powyżej 80 mg.
- Dodaj odpowiednią objętość buforu HS do wypreparowanych obszarów mózgu, aby uzyskać oczekiwany % homogenatu.
- Wykonać wir i sprawdzić, czy tkanki są całkowicie zanurzone w buforze HS.
- Homogenizuj próbki przygotowane z wypreparowanych obszarów mózgu lub rdzenia kręgowego szyjnego za pomocą młynka do tkanek składającego się z rurki ze szkła borokrzemianowego i dwóch tłuczków, A i B.
- Wlej każdy obszar mózgu do zmiażdżenia bezpośrednio do probówki. Włóż tłuczek A do rurki i schuj go. Powtórz ten ruch około dziesięć razy, aby oddzielić tkankę. Następnie użyj tłuczka B, aby kontynuować mielenie tkanki kolejnymi 20 ruchami. Przenieść homogenaty do probówki o pojemności 1,5 ml z pipetą do przenoszenia o pojemności 1 ml.
- Odwirować próbki o masie 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu wyeliminowania wszelkich niezmielonych fragmentów mózgu. Pobrać supernatanty, podzielić je na 200 μl podwielokrotności i utrzymywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.
1. Wykrywanie αS metodą ELISA
- Rozcieńczyć przeciwciała powlekające do 0,01 ng/ml. Użyj poliklonalnego lub monoklonalnego klonu królika 42 anty-αS w 50 mM Na2CO3/NaHCO3 buforze (pH 9,6).
- Pokryć 96-dołkowe mikropłytki 100 μl na studzienkę tego roztworu powlekającego i pozostawić w temperaturze 4 °C O/N. Użyj króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-αS w roztworze powlekającym dla testów ELISA przy użyciu przeciwciał detekcyjnych syn514, klon 42, LB509, AS11, 4D6 lub 8A5. Przeciwciało monoklonalne anty-αS klon 42 należy stosować jako roztwór powlekający w połączeniu z przeciwciałem wykrywającym anty-pSer129 αS.
UWAGA: Jeśli to konieczne, płytki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez tydzień przed przeprowadzeniem testu ELISA. - Za pomocą myjki do płytek umyć płytki pięciokrotnie 300 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o zawartości 0,05% Tween 20 (PBST) na studzienkę. Począwszy od tego etapu, inkubacja odbywa się w RT.
- Dodaj 200 μl buforu blokującego T20 PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) na studzienkę. Wstrząsaj przez 1 godzinę przy 150 obr./min. Umyj płytki pięć razy za pomocą PBST.
- Rozcieńczyć homogenaty mózgu (rozcieńczenie 1:100 z 20% homogenatów, 1:50 z 10% homogenatów i 1:25 z 5% homogenatów w PBST BSA 1%) i dodać 100 μl do każdej studzienki. Następnie inkubować przez 2 godziny, wytrząsając z prędkością 150 obr./min. Umyj płytki pięć razy za pomocą PBST.
- Dodać różne przeciwciała wykrywające αS w PBST z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) 1% w rozcieńczeniach wymienionych w wykazie materiałów. Inkubować przez 1 godzinę przy 150 obr./min. Umyj płytki pięć razy za pomocą PBST.
- Dodaj koniugaty IgG HRP przeciwko myszom lub królikom rozcieńczone w stosunku 1:8 000 w PBST uzupełnione BSA 1% przez 1 godzinę, wstrząsając z prędkością 150 obr./min. Umyj płytki pięć razy za pomocą PBST.
- Dodać 100 μl roztworu 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) do każdego dołka i inkubować przez 15 minut w ciemności, wytrząsając z prędkością 150 obr./min.
- Zatrzymać reakcję, dodając 100 μl 1 N HCl na studzienkę, a następnie zmierzyć absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
- W celu analizy danych należy odjąć wartość OD uzyskaną w studzience ze wszystkimi odczynnikami z wyjątkiem próbek mózgu myszy (studzienka ślepa) od wartości OD zmierzonych dla każdej z analizowanych próbek.