Modelowanie przerzutów guza mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek rakowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej

Streszczenie

Źródło: Lim, M., et al. Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej. J. Vis. Exp. (2022)

W tym filmie znieczulona mysz przechodzi zabieg chirurgiczny, w którym komórki rakowe są wstrzykiwane do wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), aby ułatwić celowe dostarczanie do mózgu. Procedura polega na precyzyjnym zszywaniu i manipulowaniu tętnicami szyjnymi w celu skierowania wstrzykniętych komórek w kierunku tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), co z czasem sprzyja powstawaniu guza w mózgu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie komórek nowotworowych do wstrzyknięcia

UWAGA: W tym badaniu wykorzystano ludzką linię komórkową raka piersi, BT-474 (BT474). BT474 hodowano w kompletnym pożywce wzrostowej zawierającej pożywkę RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 uzupełnioną 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% insuliny. Komórki utrzymywano w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla w atmosferze powietrznej. Uwierzytelnij linię komórkową za pomocą satelitarnych powtórzeń tandemowych, potwierdź ekspresję białka reporterowego (np. lucyferazy), jeśli występuje, i sprawdź, czy nie ma zakażenia mykoplazmą.

1. Wysiewaj komórki rakowe BT474 o gęstości wysiewu 2,0 × 10 ^ 6 komórek do kolby T75 przy użyciu 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej i kultury (w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla) do 70% -80% zbiegu przed wstrzyknięciem.
2. W dniu wstrzyknięcia należy wyrzucić pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć monowarstwę komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
3. Dodać 5 ml podgrzanego odczynnika do dysocjacji kultur komórkowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu odłączenia komórek. Po 5 minutach delikatnie postukać w kolbę, aby ułatwić odłączanie komórek.
4. Dodać 5 ml kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, aby ugasić aktywność odczynnika dysocjacyjnego.
5. Delikatnie zawiesić komórki przez pipetowanie, aby zmniejszyć grudki komórek.
6. Przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml i odwiruj przy 180 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
7. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) bez wapnia i magnezu, aby zminimalizować zlepianie się komórek.
8. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przy 180 x g przez 3 minut.
9. Zdekantować supernatant w celu usunięcia pozostałości surowicy/odczynnika dysocjacyjnego i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml HBSS.
10. Umieść sitko o wielkości 100 μm na świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przepuść przez nie zawiesinę komórek, aby usunąć grudki komórek.
    UWAGA: Zawiesina jednokomórkowa jest niezbędna, aby zminimalizować niedrożność naczyń krwionośnych i ryzyko udaru po wstrzyknięciu.
11. Oblicz liczbę żywotnych komórek za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i hemocytometru przy użyciu standardowych metod.
12. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową HBSS do stężenia komórek 2,5 x 10⁶ komórek/ml.
13. Trzymaj rurkę poziomo na lodzie i delikatnie kołysz rurkę od czasu do czasu, aby zminimalizować zbrylanie. Zawiesina komórek może być przechowywana na lodzie maksymalnie przez 6 godzin.
    UWAGA: Kołysanie odbywało się ręcznie, ale można to również zrobić za pomocą wytrząsarki przy niskich obrotach.

2. Przygotowanie myszy do zabiegu

UWAGA: W tym badaniu wykorzystano 4-5 tygodniowe samice myszy NOD scid. Wprowadź miękki pokarm regeneracyjny (np. żel dietetyczny, hydrożel, puree z myszy) myszom na 3 dni przed zabiegiem, aby zachęcić do karmienia po zabiegu.

1. Narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Spryskaj i przetrzyj obszar operacyjny i sprzęt środkiem do dezynfekcji powierzchni, a następnie 70% etanolem.
2. Umieść matę grzewczą dla zwierząt pod deską chirurgiczną, aby zapobiec hipotermii. Włącz to 30 minut przed zabiegiem. Spryskaj i przetrzyj deskę chirurgiczną środkiem do dezynfekcji powierzchni, a następnie 70% etanolem.
3. Przygotuj czystą klatkę dla zwierząt i ciepłą poduszkę grzewczą do rekonwalescencji.
4. Załóż czysty sprzęt ochrony osobistej (fartuch, maska, siatka na włosy i rękawiczki). Utrzymuj sterylność przez cały czas trwania zabiegu, używając czystych rękawic diagnostycznych i techniki "tylko końcówki instrumentów".
5. Znieczulij mysz komorą anestezjologiczną za pomocą 5% izofluranu o przepływie tlenu 2 l/min, aż mysz straci odruch pedałowania.
6. Wyjąć zwierzę z komory i umieścić je w stożku nosowym dostarczającym 2% izofluranu przy przepływie tlenu 2 l/min na pozostałą część zabiegu chirurgicznego.
7. Mysz do dziurkowania uszu do identyfikacji i używania elektrycznych maszynek do strzyżenia do golenia futra w okolicy szyi. Oczyść nadmiar włosów z odsłoniętej skóry za pomocą taśmy.
8. Zważ mysz, aby obliczyć wymagane dawki leków znieczulających i przeciwbólowych. Buprenorfinę i meloksykam należy podawać odpowiednio w dawkach 50 μg/kg mc. i 1 mg/kg mc. we wstrzyknięciu podskórnym.
9. Przenieś mysz na ciepłą deskę chirurgiczną i zabezpiecz stożek nosowy taśmą.
10. Nałóż lubrykant do oczu na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
11. Delikatnie zabezpiecz mysz, najpierw zaczepiając górne zęby siekaczy za pomocą nici przyklejonej do deski chirurgicznej, a następnie przyklejając taśmą przednie i tylne nogi. Ten krok wydłuża ciało i utrzymuje szyję prosto podczas zabiegu.
12. Wykonaj przedoperacyjne przygotowanie skóry zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przetrzyj szyję miejscowym środkiem antyseptycznym (powidon-jod), aby zmniejszyć obciążenie mikroflorą skóry i usunąć luźne włosy. Oczyść od środka skóry, kierując się na zewnątrz, aby zapobiec ponownemu zanieczyszczeniu miejsca nacięcia. Powtórz proces, używając 70% etanolu. Wykonaj trzy naprzemienne rundy jodu i etanolu w celu dezynfekcji.
    2. Połóż serwetę chirurgiczną na zwierzęciu. Jest on wycinany i formowany z kawałka sterylnego ręcznika papierowego lub torby autoklawu.
13. Rozłóż sterylne ręczniki papierowe lub torby autoklawe na narzędzia chirurgiczne.
14. Sprawdź odruch przez 'Test szczypania', aby zapewnić wystarczające znieczulenie przed kontynuowaniem zabiegu.

3. Wewnętrzne wstrzyknięcie do tętnicy szyjnej

UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano kaniulę infuzyjną 31 G i konfigurację strzykawko-sterownika aktywowaną stopą, aby ułatwić procedurę wstrzykiwania. Ta konfiguracja jest opcjonalna, a użytkownik może użyć strzykawki insulinowej 31 G i pominąć kroki 3.11 i 3.12. Aby przygotować kaniulę infuzyjną, należy pociągnąć i oddzielić część igły od części strzykawkowej igły 31 G za pomocą dwóch par zacisków do szwów. Następnie przymocuj część igły do jednego końca drobnej rurki infuzyjnej o długości około 10 cm.

1. Umieść mikroskop preparacyjny nad myszą.
2. Za pomocą nożyczek wykonaj pionowe nacięcie 15 mm wzdłuż linii środkowej w okolicy szyi, zaczynając od 5 mm poniżej szczęki do wlotu klatki piersiowej.
3. Za pomocą dwóch par kleszczy ustawionych pod kątem rozchyl skórę i leżące pod nią gruczoły ślinowe i zastosuj retraktory, aby tchawica była odsłonięta. Następnym krokiem będzie odsłonięcie pochewki tętnicy szyjnej, która leży równolegle do tchawicy.
4. Za pomocą dwóch par kleszczy o drobnych kątach tępo wypreparuj tkankę mięśniową i tłuszczową przylegającą do tchawicy, aby odsłonić prawą osłonkę tętnicy szyjnej. Pochewka tętnicy szyjnej to włóknista warstwa pokrywająca tętnicę szyjną wspólną, żyłę i nerw błędny, a wiązkę tę można uwidocznić za pomocą jaskrawoczerwonej tętnicy szyjnej wspólnej. W tym badaniu wstrzyknięcie wykonano na prawą tętnicę szyjną.
5. Oczyść odcinek tętnicy szyjnej wspólnej ogonowej do rozwidlenia tętnicy szyjnej otaczającej powięzi i oddziel go od nerwu błędnego i żył.
6. Odizoluj i oczyść rozwidlenie tętnicy szyjnej (połączenie, które łączy tętnice szyjne zewnętrzne i wewnętrzne) od otaczających nerwów i powięzi. Umieść cienkie kleszcze pod tętnicą szyjną zewnętrzną i przełóż szew jedwabny (o grubości 5-0) pod tętnicą. Zawiąż węzeł i zaciśnij szew i odetnij nadmiar linii.
   UWAGA: Ta ligatura (L1) zapobiegnie przedostawaniu się iniekcji przez tętnicę szyjną zewnętrzną.
7. Umieść cienkie kleszcze pod wspólną tętnicą szyjną i przełóż szew jedwabny (grubość 5-0) pod tętnicą. Zawiązać węzeł i zacisnąć szew w pozycji bliższej do proponowanego miejsca wstrzyknięcia. Odetnij nadmiar szwu, pozostawiając około 10 mm linii.
   UWAGA: Ta druga ligatura (L2) ograniczy przepływ krwi i krwawienie po wstrzyknięciu. Służy również do ustawiania i przytrzymywania tętnicy szyjnej podczas wstrzyknięcia.
8. Wytnij i zwilż pasek (autoklawowanych) jednorazowych wycieraczek o niskiej zawartości włókien o wymiarach około 10 mm x 5 mm. Złożyć pasek o wymiarach 4 mm x 5 mm o grubości 2-3 mm i umieścić go pod tętnicą szyjną w proponowanym miejscu wstrzyknięcia. Spowoduje to podparcie naczynia podczas wstrzyknięcia.
9. Na tętnicy szyjnej wspólnej rostralnej do proponowanego miejsca wstrzyknięcia umieścić trzecie podwiązanie (L3) z luźnym węzłem. Jest on dokręcany dopiero po wstrzyknięciu (w kroku 3.16).
10. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i pobrać 200 μl zawiesiny komórkowej do strzykawki insulinowej (z igłą 31 G).
11. Załadować strzykawkę do sterownika strzykawki, który jest podłączony do aktywującego pedału nożnego.
12. Przymocuj cienką kaniulę z igłą 31 G do strzykawki i zalej linię.
13. Sprawdź, czy tętnica szyjna jest dobrze ustawiona i pod ciśnieniem.
14. Za pomocą dwóch cienkich kleszczyków kątowych, z których jeden delikatnie napina się na końcu pierwszej ligatury, a drugi trzyma igłę 31 G, powoli włóż igłę skosem do góry w światło naczynia krwionośnego, uważając, aby jej nie przebić.
15. Powoli wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórkowej (z kroku 1.13) do tętnicy szyjnej wspólnej w stężeniu 10 μl/s. Spowoduje to dostarczenie 2,5 × 10 ^ 5 komórek do naczynia krwionośnego. Udane wstrzyknięcie jest wizualizowane przez oczyszczanie krwi z naczynia krwionośnego tętnicy szyjnej.
16. Delikatnie podnieść i zacisnąć luźną ligaturę (L3) (od kroku 3.9) natychmiast po wyjęciu igły, aby zapobiec cofaniu się i krwawieniu. Przyciąć nadmiar szwu.
    UWAGA: To normalne, że po wyjęciu igły tryska niewielka ilość krwi. Nie może jednak wystąpić aktywne krwawienie po zaciśnięciu trzeciej ligatury.
17. Usuń kawałek zwilżonych, niestrzępiących się jednorazowych wycieraczek.
18. Za pomocą pipety P200 dwukrotnie przepłukać jamę operacyjną 150-200 μl sterylnej wody lub soli fizjologicznej.
19. Sprawdź ponownie, czy nie ma krwawienia, a następnie wyjmij zwijacze.
20. Zmień położenie tkanek miękkich, gruczołów ślinowych i skóry nad tętnicą szyjną i tchawicą.
21. Zamknij warstwę skóry nacięcia za pomocą uchwytu na igłę do szwów, kleszczyków i wchłanialnego lub niewchłanialnego szwu monofilamentowego 6/0 w ciągły wzór.
22. Wyrzuć strzykawkę z igłą do kaniuli i przygotuj nową konfigurację dla następnej myszy. Użycie nowej strzykawki zapewni, że liczba komórek wstrzykniętych każdej myszy będzie stała.
    UWAGA: Reprezentatywne migawki z zabiegu znajdują się w Jeśli naczynie zostanie przebite lub rozerwane przez igłę, co wskazuje na wyciek wstrzyknięcia lub krwawienie, zabieg uznaje się za nieudany. Następnie igłę należy wyjąć, a trzecią ligaturę natychmiast zacisnąć, aby zapobiec dalszemu krwawieniu. Jeśli krwawienie utrzymuje się po zaciśnięciu szwu, zwierzę musi zostać poddane eutanazji za pomocą pentobarbitalu.

4. Rekonwalescencja po wstrzyknięciu

1. Wstrzyknij buprenorfinę (50 μg/kg) i meloksykam (1 mg/kg) przez wstrzyknięcie podskórne jako ulgę w bólu pooperacyjnym.
2. Przenieś zwierzę do ciepłej i czystej klatki, aby wyzdrowiało ze znieczulenia. To normalne, że zwierzę po przebudzeniu ma przytłumioną aktywność (skulone i nieaktywne lub poruszające się powoli).
3. Po 30-45 minutach przenieś myszy do długoterminowego przetrzymywania.
4. Zapewnij myszom miękką dietę (żel dietetyczny, hydrożel, zacier) przez co najmniej tydzień po operacji i codziennie sprawdzaj stan fizyczny, zwracając uwagę na oznaki udaru, infekcji i krwawienia wokół miejsca rany.
5. Dwa dni po operacji typowe jest, że zwierzę ma zmniejszoną aktywność, łagodną potarganą sierść i straciło 15% masy ciała przed operacją. Podawaj leki przeciwbólowe (meloksykam) codziennie przez 2-3 dni po operacji, aby opanować ból i wspomóc powrót do zdrowia.
6. Od 3 dnia zwierzęta muszą odzyskać aktywność, zwiększyć częstotliwość karmienia i pielęgnacji oraz odzyskać wagę. Eutanazja zwierząt z utrzymującymi się deficytami kondycji fizycznej (ból, skulenie, brak aktywności, utrata masy ciała) po 4 dniach od operacji poprzez wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu w dawce 200 mg/kg przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.
7. Wszczepienie i progresję guza można monitorować za pomocą znieczulenia i wybranej metody obrazowania, takiej jak obrazowanie bioluminescencyjne, MRI lub PET/MRI. Wymóg i zdolność do wykonania takiego obrazowania będą z natury zależne od indywidualnych celów projektu i obiektu, w którym jest ono wykonywane, a także w zależności od rodzaju znacznika reporterowego, użytych linii komórkowych, dostępności odpowiednich urządzeń radiochemicznych i obrazowania jądrowego.
   UWAGA: Niektóre zwierzęta mogą nie reagować dobrze i doświadczać udaru pomimo udanego zabiegu. Po zabiegu zwierzęta, które wykazują jakiekolwiek objawy niepokoju neurologicznego (odwracanie głowy i ciągnięcie na bok, krążenie, turlanie się, rzucanie, utrata funkcji motorycznych) muszą zostać natychmiast poddane eutanazji.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu iniekcji do tętnicy szyjnej wewnętrznej w przypadku przerzutów do mózgu. Wstrzyknięcie do tętnicy szyjnej wewnętrznej z podwiązaniem tętnicy szyjnej zewnętrznej może niezawodnie wytworzyć model przerzutów do mózgu z różnych nowotworów pierwotnych. W tym protokole trzy ligatury są umieszczane na t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
30G Igła do mikrolancy	BD	23748
31G Ultra-Fine II	BD	326103
Kleszczyki kątowe	Proscitech	T67A-SS	Drobno spiczaste, kątowe bez ząbkowania, końcówka 18mm, długość 128 mm
Mata grzewcza
Antybiotyk i środek przeciwgrzybiczy	ThermoFisher Scientific	15240062
BT-474 (HTB-20) linia komórkowa raka piersi	ATCC	HTB-20
Buprenorfina (TEMGESIC)
Licznik komórek hrabiny	ThermoFisher Scientific	C10227
Mikroskop
Ucho dziurkacz
Maszynki
Szczypce kątowe	Proscitech	DEF11063-07	Kątowe 45°, Końcówka gładka, Szerokość końcówki: 0,4 mm, Wymiar końcówki: 0,4 x 0,3 mm, długość 9cm
Cienkie rurki do kaniuli, Średnica zewnętrzna rurki (in) 1/32, ID rurki (cale) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Surowica bydlęca płodu	ThermoFisher Scientific	26140079
Zbilansowany roztwór soli Hanka bez wapnia i magnezu	ThermoFisher Scientific	14170120
Isofluran
Kimwipes Jednorazowe chusteczki	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Chusta dla myszy
Meloxicam (METACAM)
Stożek			nosowyWykonany z rurki do mikrofugi
Lubrykant do oczu PAA (karbomer 2 mg / g)Bausch and lomb	Roztwór jodu powidonu Betadine	2505692	PPE (rękawica, maska, fartuch, siatka na włosy)
Zwijacze	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Jedwabny szew 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterylna sól fizjologiczna ThermoFisher	Scientific	TM4469
Taśma
Deska			Deska do krojenia owinięta w torbę do sterylizacji w autoklawie.
Nożyczki chirurgiczne	Proscitech	T104	Wymiary końcówki (dł. x gł.): 38x7mm, długość 115mm
Kleszczyk do szwów/ Zakrzywione kleszcze Brophy	Proscitech	T113C	Zakrzywione, zaokrąglone wąskie końcówki 2 mm, z ząbkami, długość 165 mm
Uchwyt na igłę do szwów (uchwyt na igłę Olsen Hegar)	Proscitech	TC1322-180	długość 190 mm, zacisk zapadkowy
Sterownik strzykawki z pedałem nożnym/ UMP3 Ultra mikropompa	World Precision Instruments	UMP3-3
Kolba do hodowli tkankowych T75	ThermoFisher Scientific	156499
Wątek
Trigene II płyn do dezynfekcji powierzchni	Ceva

dla zwierząt preparacyjnydo strzyżenia elektrycznego klejąca chirurgiczna