Analiza LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny wyizolowanych z ludzkiej tkanki mózgowej

Streszczenie

Źródło: Wulf, M., et.al. Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film przedstawia analizę próbek peptydów z granulek neuromelaniny (NMG) wyizolowanych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej. Peptydy są najpierw rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), a następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu określenia ich stosunku masy do ładunku (m / z). Docelowe peptydy są fragmentowane w celu zidentyfikowania modyfikacji potranslacyjnych, a uzyskane dane są porównywane z referencyjną bazą danych w celu określenia profilu proteomicznego NMG.

Protokół

1. Trawienie tryptyczne

1. Rozmrażanie próbek na lodzie.
2. Całkowicie wysuszyć próbki w koncentratorze próżniowym.
3. Wypełnić próbkę 50 μl odpowiedniego buforu do wytrawiania, np. 50 mM wodorowęglanu amonu.
4. Po dodaniu 1,25 μl z 200 mM 1,4-ditiotreitolu, próbki inkubować przez 30 minut w temperaturze 60 °C i 300 obr./min przy użyciu termomiksera, a następnie schłodzić je do temperatury pokojowej (RT).
5. Następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności po dodaniu 1,36 μl 0,55 M jodoacetamidu.
6. Dodać odpowiednią ilość trypsyny do próbek i inkubować próbki przez noc (~16 h) w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Dla 1 000 000 μm² 0,1 μg trypsyny okazało się wystarczające.
7. Dodać 2,6 μl 10% kwasu trifluorooctowego (TFA) do próbek, aby zatrzymać trawienie (stężenie końcowe 0,5% TFA).
8. Całkowicie wysuszyć próbki za pomocą koncentratora próżniowego. Następnie należy napełnić próbki do określonej objętości końcowej 0,1% TFA. Próbki NMG wypełniono do 20 μl, z czego 5 μl użyto do jednego eksperymentu ze spektrometrią mas (MS).
9. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. Określić stężenie peptydów za pomocą analizy aminokwasów lub innej odpowiedniej metody kwantyfikacji (np. Direct Detect).
UWAGA: Niskie ilości próbek mogą nie być możliwe do oszacowania przy użyciu wymienionych technik. Aby zapewnić identyczne obciążenie próbki, każda próbka powinna zawierać taką samą ilość wyizolowanej tkanki, a każda próbka powinna być traktowana jednakowo.

2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa i spektrometria mas

UWAGA: Następujące analizy spektrometrii mas (MS) wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) są zoptymalizowane dla specyficznego systemu LC z zastosowanym tutaj urządzeniem do kolumny pułapkującej i spektrometrem masowym (patrz Tabela materiałów). W przypadku innych systemów LC i MS zalecana jest adaptacja parametrów.

1. Korzystając z oprogramowania Xcalibur, dostosuj ustawienia HPLC w następujący sposób.
   1. Kolumna pułapki: Ustawić temperaturę na 60 °C, natężenie przepływu na 30 μL/min, uruchomić bufor na 0,1% kwasu trifluorooctowego.
   2. Analityczna kolumna C18 z odwróconymi fazami: ustawić temperaturę na 60 °C, natężenie przepływu na 30 μl/min, bufor A do 0,1% kwasu trifluorooctowego, bufor B do 84% acetonitrylu i gradient do 5%-30% buforu B przez 98 min.
      UWAGA: Adaptacja gradientu może być nieunikniona i jest zdecydowanie zalecana w przypadku stosowania różnych tkanek lub komórek. Całkowity czas gradientu może się różnić ze względu na obciążenie próbki na początku gradientu i mycie próbki na końcu gradientu. Całkowite nachylenie w tym protokole składa się z 7-minutowego ładowania próbki i dodatkowego mycia kolumny przez 15 minut, co daje całkowity czas gradientu wynoszący 120 minut.
2. Utwórz metodę akwizycji zależnej od danych (DDA) za pomocą konfiguracji instrumentu XCalibur, którą można znaleźć w menu mapy drogowej oprogramowania HPLC.
3. W zakładce Parametry globalne zdefiniuj tryb infuzji Chromatografia cieczowa, Oczekiwana szerokość piku LC (30 s) oraz Domyślny stan naładowania (2).
4. Przejdź do zakładki Scan Parameters i dodaj następujące skany i filtry w podanej kolejności: MS OT, MIPS, Intensity, Charge State, Dynamic exclusion, i ddMS2 OT HCD.
   Optymalne ustawienia MS i DDA mogą się różnić w zależności od używanego spektrometru masowego, a także typu próbki i dlatego powinny być dostosowane.
5. Przygotować próbki, rozpuszczając 200-400 ng peptydów próbki w określonej objętości 0,1% TFA we wlotach fiolek ze szkła obojętnego do spektrometrii mas. Jeśli oznaczanie stężenia nie ma zastosowania ze względu na małą ilość próbki, należy sprawdzić identyczne obciążenie próbki, porównując całkowity prąd jonowy (TIC).
   UWAGA: Aby to zrobić, otwórz wynikowy plik pomiaru spektrometrii mas w odpowiednim oprogramowaniu, np. FreeStyle, i sprawdź chromatogram. Natężenia powinny być porównywalne dla wszystkich próbek. Reprezentatywny TIC jest pokazany na Rysunek 1.
6. Przeanalizuj surowe dane uzyskane za pomocą odpowiedniego oprogramowania proteomicznego, np. MaxQuant, Progenesis QI for Proteomics lub Proteome Discoverer, i przeprowadź analizę danych statystycznych w oparciu o pytanie badawcze.

3. Analiza surowych danych proteomicznych za pomocą MaxQuant

1. Załaduj surowe pliki do oprogramowania MaxQuant w nagłówku danych surowych, klikając Załaduj.
2. Przypisz nazwy próbek, klikając na Set Experiment.
3. Zdefiniuj parametry specyficzne dla grupy. Najpierw dodaj modyfikacje. Ze względu na przetwarzanie próbki, wybierz Deamidacja (NQ), Utlenianie (M) i Karbamidometyloacja (N-term) jako zmienne modyfikacje i dodaj Carbamidomethylation (C) jako stałą modyfikację.
4. Wybierz Trypsyna jako enzym trawienny w Trawienie zakładka.
5. Dodaj opcję kwantyfikacji bez etykiety LFQ w zakładce Oznaczanie ilościowe bez etykiet . Jeśli ma być przetwarzanych więcej niż 10 plików, wybierz opcję Fast LFQ, aby skrócić czas przetwarzania. Dodano opcję iBAQ jako miarę do oznaczania ilościowego białka.
6. Upewnij się, że wszystkie inne parametry specyficzne dla grupy pozostają w ustawieniach fabrycznych.
7. Przejdź do zakładki Parametry globalne i dodaj plik FASTA pochodzący z uniprot.org w zakładce Sekwencje . Zmodyfikuj odpowiednio regułę identyfikatora i dodaj identyfikator taksonomii, w tym przypadku 9606 dla homo sapiens.
8. Do oznaczania ilościowego białka wybierz peptydy Unique i Razor.
9. Upewnij się, że wszystkie inne parametry globalne pozostają w ustawieniach fabrycznych.
10. Kliknij Start i pobierz proteingroups.txt dane wyjściowe po analizie MaxQuant w celu dalszej analizy w Perseus.

Wyniki

Rysunek 1: Całkowity prąd jonów (TIC) podczas 120-minutowego pomiaru DDA. Chromatogram pokazuje względną obfitość jonów odpowiadających peptydom eluującym w zakres...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,4-dithiothreitol	AppliChem	A1101
Acetonitryl	Merck	1.00029.2500
Wodorowęglan amonu	Sigma-Aldrich	A6141
Kwas mrówkowy	Sigma-Aldrich	56302
Iodoacetamid	AppliChem	A1666,0100
Rurka Micro 500	Carl Zeiss	415190-9221-000 style='styl obramowania-w lewo:brak; styl górnej krawędzi:brak; szerokość:120pkt;'
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
kwas trifluorooctowy	Merck	91707
Stopień sekwencjonowania trypsyny	Serva
Ultimate 3000 RSLC nano LC system<	ULTIM3000RSLCNANO
nazwa oprogramowania	Weblink/Company	Version
FreeStyle	Thermo Fisher Scientific	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3

td style='styl obramowania-lewo:brak;styl-górny-obramowania:brak;szerokość:217pt;'>Thermo Fisher Scientific