Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyodrębnianie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowej populacji wirusów z wykorzystaniem chromatografii na hydroksyapatycie

31.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3146

⸱

29 września 2011

 ,  , 
1Department of Microbial and Environmental Genomics, The J. Craig Venter Institute, 2Department of Synthetic Biology and Bioenergy, The J. Craig Venter Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy wydajną metodę oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz cząsteczek RNA z wirusowych społeczności środowiskowych. Kwasy nukleinowe są frakcjonowane przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie z zastosowaniem rosnących stężeń buforów zawierających fosforany. Metoda ta umożliwia izolację wszystkich typów wirusowych kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych.

Streszczenie

Wirusy, w szczególności bakteriofagi (fagi), są najliczniejszymi bytami biologicznymi na Ziemi1,2. Wirusy modulują liczebność i różnorodność komórek gospodarza, przyczyniają się do obiegu składników odżywczych, zmieniają fenotyp komórki gospodarza oraz wpływają na ewolucję zarówno społeczności komórek gospodarzy, jak i społeczności wirusów poprzez lateralny transfer genów 3. Liczne badania podkreśliły oszałamiającą różnorodność genetyczną wirusów oraz ich potencjał funkcjonalny w wielu środowiskach naturalnych.

Techniki metagenomiczne są wykorzystywane do badania różnorodności taksonomicznej i potencjału funkcjonalnego złożonych zespołów wirusowych, których członkowie posiadają genotypy jednoniciowego DNA (ssDNA), dwuniciowego DNA (dsDNA) oraz RNA 4-9. Obecne protokoły przygotowywania bibliotek stosowane do badania wirusów środowiskowych zawierających DNA lub RNA wymagają wstępnej obróbki nukleazami w celu usunięcia matryc niebędących celem badania 10. Jednakże pełne zrozumienie zbiorczego zestawu genów społeczności wirusów oraz ich różnorodności wymaga wiedzy o wszystkich członkach, niezależnie od składu genomu. Frakcjonowanie oczyszczonych podtypów kwasów nukleinowych stanowi skuteczny mechanizm badania zespołów wirusowych bez utraty części sygnatury genetycznej danej społeczności.

Hydroksyapatyt, krystaliczna forma fosforanu wapnia, jest wykorzystywany w separacji kwasów nukleinowych, a także białek i drobnoustrojów od lat 60. XX wieku11. Poprzez wykorzystanie oddziaływań ładunkowych między dodatnio naładowanymi jonami Ca2+ hydroksyapatytu a ujemnie naładowanym szkieletem fosforanowym podtypów kwasów nukleinowych, możliwe jest preferencyjne eluowanie każdego podtypu kwasu nukleinowego niezależnie od pozostałych. Niedawno zastosowaliśmy tę strategię do niezależnego frakcjonowania genomów wirusów zawierających ssDNA, dsDNA i RNA w celu przygotowania do sekwencjonowania DNA 12. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę frakcjonowania i odzyskiwania wirusowych kwasów nukleinowych ssDNA, dsDNA i RNA z mieszanych zbiorów wirusowych przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

Przed przeprowadzeniem chromatografii na hydroksyapatycie należy przygotować bufory fosforanowe oraz odpowiednio nawodnić hydroksyapatyt.

  1. 1M roztwór fosforanowy, pH 6,8: W kolbie o pojemności 1L rozpuścić 19,98g fosforanu sodu jednowodnego w 1L sterylnej wody H2O traktowanej DEPC. Przygotować 1M roztwór fosforanu sodu dwuzasadowego w kolbie o pojemności 1L, rozpuszczając 141,96g fosforanu sodu dwuzasadowego w 1L sterylnej wody H2O traktowanej DEPC. Połączyć roztwory jednoskładnikowy i dwuskładnikowy w stosunku 1:1. Umieścić kolbę na mieszadle magnetycznym i mieszać za pomocą mieszadełka magnetycznego. Dostosować pH do 6,8, dodając wodorotlenek sodu (aby zwiększyć pH) lub kwas fosforowy (aby zmniejszyć pH).
  2. Bufor fosforanowy 0,12M: W kolbie o pojemności 500ml połączyć 30ml 1M roztworu fosforanowego (pH 6,8), 2,5ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 5ml 0,5M EDTA. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 25ml. Dostosować pH do 6,8. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 250ml. Autoklawować.
  3. Bufor fosforanowy 0,18M: W kolbie o pojemności 50ml połączyć 45ml 1M roztworu fosforanowego (pH 6,8), 2,5ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 5ml 0,5M EDTA. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 25ml. Dostosować pH do 6,8. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 250ml. Autoklawować.
  4. Bufor fosforanowy 0,20M: W kolbie o pojemności 50ml połączyć 50ml 1M roztworu fosforanowego (pH 6,8), 2,5ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 5ml 0,5M EDTA. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 25ml. Dostosować pH do 6,8. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 250ml. Autoklawować.
  5. Bufor fosforanowy 0,40M: W kolbie o pojemności 50ml połączyć 100ml 1M roztworu fosforanowego (pH 6,8), 2,5ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 5ml 0,5M EDTA. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 25ml. Dostosować pH do 6,8. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 250ml. Autoklawować.
  6. „Bufor fosforanowy 1,0M” (rzeczywiste stężenie fosforanu w tym roztworze wynosi 0,91M): W kolbie o pojemności 50ml połączyć 30ml 1M roztworu fosforanowego (pH 6,8), 2,5ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 5ml 0,5M EDTA. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 25ml. Dostosować pH do 6,8. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 250ml. Autoklawować.
  7. Hydratacja hydroksyapatytu: Odważyć 1g hydroksyapatytu i przenieść do probówki o pojemności 50ml. Dodać 6ml buforu fosforanowego 0,12M do hydroksyapatytu i wymieszać przez odwracanie probówki. Przed użyciem podgrzać do temperatury 60°C i dokładnie wymieszać. Przechowywać przez dłuższy czas w temperaturze 4°C.
  8. Przed użyciem doprowadzić wszystkie bufory fosforanowe i hydratowany hydroksyapatyt do temperatury 60°C.

2. Przygotowanie kolumny Econo-Column

  1. Zamknąć kurek. Przepłukać kolumnę kilka razy dejonizowaną wodą H2O poprzez wielokrotne odwracanie kolumny i zlewanie zawartości.
  2. Wyjąć kurek z kolumny Econo-column i wysterylizować kolumnę w autoklawie.
  3. Ponownie włożyć i zamknąć kurek. Dodać 1ml Sigmacote do sterylnej kolumny Econo-column i pokryć wszystkie szklane powierzchnie. Otworzyć kurek i zlać zawartość.
  4. Podłączyć kolumnę do cyrkulacyjnej kąpieli wodnej i ustawić temperaturę na 60°C. Aby zapewnić minimalne straty ciepła wzdłuż kolumny, zaleca się owinięcie jej materiałem izolacyjnym, takim jak folia aluminiowa lub piankowa izolacja rur.
  5. Przepłukać kolumnę Econo-column dwukrotnie sterylną wodą H2O wolną od RNaz, a następnie dwukrotnie sterylnym, wolnym od RNaz buforem fosforanowym 0,12M.

3. Chromatografia na hydroksyapatycie

  1. Upewniając się, że kurek jest zamknięty, powoli dodaj 2ml wcześniej przygotowanej, resuspendowanej hydroksyapatytu na dno kolumny Econo za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 2ml.
  2. Pozostaw hydroksyapatyt do osadzenia pod wpływem siły grawitacji przez 30 minut.
  3. Odprowadź bufor z kolumny i zamknij kurek. Połącz kwasy nukleinowe z buforem fosforanowym 0,12M do końcowej objętości 50 μl i inkubuj w temperaturze 60°C przez 10 minut w bloku grzejnym lub kąpieli wodnej.
  4. Szybko nanieś przygotowane w buforze fosforanowym 0,12M kwasy nukleinowe na hydroksyapatyt za pomocą pipety serologicznej 2ml, dbając o to, aby nie naruszyć wypełnienia kolumny.
  5. Pozostaw kwasy nukleinowe do związania z hydroksyapatytem na 30 minut.
  6. Umieść probówkę 15ml pod kolumną, otwórz kurek i zbierz pierwszą frakcję zawierającą ssDNA. Zamknij kurek.
  7. Dodaj 6ml buforu fosforanowego 0,12M do hydroksyapatytu, uważając, aby nie naruszyć wypełnienia kolumny, otwórz kurek i zbierz jednoniciowy DNA do probówki 15ml z poprzedniego kroku. Zamknij kurek.
  8. Dodaj do probówki 1 objętość roztworu fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:25:1 v/v/v), wymieszaj energicznie i wiruj przy 350 x g przez 15 minut. Przenieś nadsącz zawierający ssDNA do nowej probówki 15ml.
  9. Powtórz kroki 3.76 i 3.87, używając 6ml buforu fosforanowego 0,20M w celu elucji i oczyszczania RNA z kolumny, pamiętając o zastosowaniu nowej probówki 15ml do zbierania frakcji.
  10. Powtórz kroki 3.76 i 3.87, używając 6ml buforu fosforanowego 0,40M w celu elucji i oczyszczania dsDNA z kolumny, pamiętając o zastosowaniu nowej probówki 15ml do zbierania frakcji.
  11. Powtórz kroki 3.76 i 3.87, używając 6ml buforu fosforanowego 1,0M w celu całkowitego wypłukania pozostałego dsDNA z kolumny, pamiętając o zastosowaniu nowej probówki 15ml do zbierania frakcji.

4. Odsalanie próbek kwasów nukleinowych

  1. Przenieś 4-5ml próbki do urządzenia do filtrowania odśrodkowego Amicon Ultra-4 wyposażonego w membranę Ultracel z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 30 0.
  2. Skoncentruj próbkę do objętości < 50μl, wirując przy 6 0 x g, 30°C przez 5 minut (lub do momentu uzyskania pożądanej objętości koncentratu) w rotorze z kątem stałym. Odlej filtrat.
  3. Dodaj pozostałą część próbki(i) do urządzenia do filtrowania odśrodkowego Amicon Ultra-4 i uzupełnij objętość do 4-5ml za pomocą wolnego od RNazy buforu 1X TE.
  4. Skoncentruj próbkę do objętości < 50μl, wirując przy 6 0 x g, 30°C przez 5 minut (lub do momentu uzyskania pożądanej objętości koncentratu) w rotorze z kątem stałym. Odlej filtrat.
  5. Dodaj 4-5ml wolnego od RNazy buforu 1X TE do urządzenia do filtrowania odśrodkowego Amicon Ultra-4. Skoncentruj próbkę do objętości < 50μl, wirując przy 6 0 x g, 30°C przez 5 minut (lub do momentu uzyskania pożądanej objętości koncentratu) w rotorze z kątem stałym. Odlej filtrat.
  6. Powtórz krok 4.5 jeszcze 5 razy, aby całkowicie odsolić próbkę(i) kwasów nukleinowych.
  7. Przenieś pozostałą próbkę(i) do sterylnej probówki typu eppendorf o pojemności 1,7ml. Dodaj 1/10 objętości 3M octanu sodu, pH 7.0, dwie objętości 100% etanolu oraz 1μl Glycoblue. Wymieszaj dokładnie za pomocą wortexa.
  8. Wiruj przy 28 00 x g, 4°C przez 60 minut. Odlej nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj 30μl 70% etanolu. Wiruj przy 28 0 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odlej nadsącz, wysusz i resuspenduj każdą frakcję w odpowiedniej objętości wolnego od RNazy buforu TE.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1 podsumowuje przedstawione metody wykorzystania chromatografii na hydroksyapatycie do frakcjonowania kwasów nukleinowych ssDNA, dsDNA i RNA z mieszanej populacji wirusów. Metoda ta wykorzystuje oddziaływanie ładunków między ujemnie naładowanym szkieletem fosforanowym kwasów nukleinowych a dodatnio naładowanymi jonami Ca2+ obecnymi w hydroksyapatycie, co pozwala na efektywne frakcjonowanie podtypów kwasów nukleinowych (ssDNA, dsDNA i RNA) przy zwiększających się stężeniach buforu fosforanowego 12.

Frakcjonowanie na hydroksyapatycie „społeczności” in vitro znanych genomów wirusowych ssDNA (M13mp18), dsDNA (lambda) oraz RNA (MS2 i phi6) przedstawiono na Rysunku 2. Kwasy nukleinowe połączono w równych stężeniach, nałożono na kolumnę z hydroksyapatytem, a następnie elukowano przy użyciu rosnącego stężenia buforu fosforanowego. Każdy podtyp kwasu nukleinowego elukuje niezależnie od pozostałych, przy przeniesieniu mniej niż 9% materiału z jednej frakcji do kolejnej.

Zastosowanie tej techniki w odniesieniu do kwasów nukleinowych wyizolowanych ze zbiorowiska wirusów pobranego z zatoki Chesapeake przedstawiono na Rysunku 3. Całkowita wydajność kwasów nukleinowych wyizolowanych z oczyszczonych wirusów została naniesiona na kolumnę z hydroksyapatytem. Materiał genomiczny składający się z ssDNA, RNA i dsDNA został niezależnie eluowany odpowiednio przy stężeniach 0,12 M, 0,20 M oraz 0,40 M/1,0 M buforu fosforanowego. Dwuniciowy DNA jest eluowany przy stężeniach fosforanu 0,40 M i 1,00 M i w tym przypadku dominuje w tym zbiorowisku wirusów w porównaniu do genotypów ssDNA i RNA. Obserwacja ta jest zgodna z oczekiwanym składem zbiorowisk wirusowych w środowiskach morskich i estuariowych, gdzie większość odzyskiwalnych kwasów nukleinowych to dsDNA 13.

Separacja kwasów nukleinowych za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej. Wiązanie DNA i RNA w temperaturze 60°C, gradient buforowy.
Rycina 1. Schemat blokowy metody chromatografii na hydroksyapatycie w celu frakcjonowania kwasów nukleinowych. Mieszaninę ssDNA, dsDNA i RNA przygotowaną w buforze fosforanowym 0,12 M podgrzewa się do 60°C i naniesiono na kolumnę z hydroksyapatytem utrzymywaną w stałej 60°C przy użyciu łaźni wodnej z cyrkulacją. Kwasy nukleinowe (ssDNA, RNA i dsDNA) są eluowane z hydroksyapatytu przy użyciu rosnących stężeń buforu zawierającego fosforany. Rysunek ten został powielony za zgodą American Society of Microbiology i pierwotnie pojawił się w publikacji Andrews-Pfannkoch et al. 201012.

Wynik elektroforezy żelowej; rozdział prążków DNA; podpisane ścieżki; widoczny marker masy cząsteczkowej.
Rysunek 2. Rozdzielanie znanych kwasów nukleinowych wirusów za pomocą chromatografii na hydroksyapatycie. Równe stężenia ssDNA M13mp18, ssRNA MS2, dsRNA phi6 oraz dsDNA lambda (odpowiednio ścieżki 2–5) zostały połączone (ścieżka 6) i naniesione na kolumnę z hydroksyapatytem. Jednoniciowy DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6) oraz dsDNA (lambda) zostały niezależnie wymyte z kolumny z hydroksyapatytem przy użyciu roztworów 0,12 M (ścieżka 8), 0,18 M (ścieżka 9) oraz 0,40 M/1,0 M (ścieżka 10). Do potwierdzenia wielkości genomów użyto drabinki 1 kb (ścieżki 1, 7). Rysunek ten został powielony za zgodą American Society of Microbiology i pierwotnie pojawił się w pracy Andrews-Pfannkoch et al. 2010.12.

Wynik elektroforezy DNA; porównanie ścieżek; drabinka wskazuje rozmiary fragmentów do analizy molekularnej.
Rysunek 3. Separacja kwasów nukleinowych wirusów wyizolowanych z populacji w zatoce Chesapeake. Kwasy nukleinowe zostały wyizolowane i naniesione na kolumnę z hydroksyapatytem. ssDNA (ścieżka 0,12 M), RNA (ścieżka 0,20 M) oraz dsDNA (ścieżki 0,40 M/1,0 M) zostały niezależnie eluowane przy użyciu buforu fosforanowego o stężeniach odpowiednio 0,12 M, 0,20 M oraz 0,40 M/1,0 M. Do wizualnego potwierdzenia przybliżonej masy cząsteczkowej i masy kwasów nukleinowych użyto markerów Hi Mass DNA Ladder (ścieżka L1) oraz 1kb Ladder (ścieżka L2). Rycina ta została powielona za zgodą American Society of Microbiology i pierwotnie pojawiła się w pracy Andrews-Pfannkoch et al. 2010.12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metodologia chromatografii na hydroksyapatycie jest wysoce wydajnym i niezawodnym narzędziem do frakcjonowania kwasów nukleinowych z mieszanych zespołów wirusowych, gdy celem jest badanie łącznie skład kwasów nukleinowych w obrębie społeczności. Zazwyczaj ssDNA, RNA i dsDNA będą eluowane z kolumny przy stężeniach buforu fosforanowego przekraczających w przybliżeniu˜ odpowiednio 0 i 0,40 M. Należy jednak pamiętać, że każda partia hydroksyapatytu może mieć nieco inny skład i profil elucji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez Office of Science (BER) Departamentu Energii USA w ramach umowy o współpracy nr De-FC02-02ER63453 oraz przez Program Sekwencjonowania Genomów Mikrobowych National Science Foundation (numery grantów 0626826 i 0731916). Dziękujemy Johnowi Glassowi za wiedzę techniczną i porady oraz K. Ericowi Wommackowi za pomoc w pobieraniu próbek środowiskowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolumna Econo-ColumnBio-Rad737-0717wewnętrzna średnica 0.7cm opakowanie/2
HydroksyapatytBio-Rad130-0520Bio-Gel HTP Gel stopień DNA, 100g/td>
Fosforan sodu, jednowodnyVWR internationalVW1497-01Monohydrat, kryształ 500g
Fosforan sodu, dwuzasadowyVWR internationalVW1496-01Bezwodny, proszek 500g
Woda traktowana DEPCInvitrogenAM99221L
10% roztwór SDSInvitrogen24730-020UltraPure, 1L
0.5M EDTAInvitrogenAM9262pH 8.0, 1L
SigmacoteSigma-AldrichSL2-25ML
pipeta serologiczna 2mlVWR international89130-884polistyrenowa, sterylna
Probówki wirówkowe BD FalconVWR international21008-93615ml, sterylne
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1 v/v/v)Invitrogen15593-031UltraPure, 100ml
Urządzenie do wirowania Amicon Ultra-4EMD MilliporeUFC803024membrana Ultracel-30
Bufor TE 20X, wolny od RNazInvitrogenT11493100ml
GlycoblueInvitrogenAM951615mg/ml

Bibliografia

  1. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
  2. Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).
  3. Weinbauer, M. G. Bacteriophages: Evolution of the Majority. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).
  4. Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes. Nature. 455, 830-830 (2008).
  5. McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression. PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).
  6. Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples. PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).
  7. Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. RNA Viruses in the Sea. FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).
  8. Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics. J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).
  9. Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics. J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).
  10. Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities. Science. 312, 1795-1795 (2006).
  11. Bernardi, G. Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite. Nature. 209, 779-779 (1965).
  12. Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages. Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).
  13. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Separacja kwas w nukleinowychwirusowe kwasy nukleinoweeluowanie buforem fosforanowymwirusy RNAodsalanie kwas w nukleinowychelektroforeza elowa
Wyodrębnianie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowej populacji wirusów z wykorzystaniem chromatografii na hydroksyapatycie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.