Artykuł metodologiczny

Oddzielenie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA i RNA od środowiskowej społeczności wirusowej za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej

DOI:

10.3791/3146

⸱

29 września 2011

 ,  , 
1Department of Microbial and Environmental Genomics, The J. Craig Venter Institute, 2Department of Synthetic Biology and Bioenergy, The J. Craig Venter Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy skuteczną metodę oddzielania jednoniciowego, dwuniciowego DNA i cząsteczek RNA od środowiskowych społeczności wirusowych. Kwasy nukleinowe są frakcjonowane za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej ze zwiększaniem stężeń zawierających fosforany. Metoda ta pozwala na izolację wszystkich typów wirusowych kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirusy, szczególnie bakteriofagi (fagi), są najliczniejszymi jednostkami biologicznymi na Ziemi1,2. Wirusy modulują liczebność i różnorodność komórek gospodarza, przyczyniają się do obiegu składników odżywczych, zmieniają fenotyp komórek gospodarza i wpływają na ewolucję zarówno komórek gospodarza, jak i społeczności wirusowych poprzez boczny transfer genów 3. Liczne badania podkreśliły oszałamiającą różnorodność genetyczną wirusów i ich potencjał funkcjonalny w różnych środowiskach naturalnych.

Techniki metagenomiczne zostały wykorzystane do zbadania różnorodności taksonomicznej i potencjału funkcjonalnego złożonych zespołów wirusowych, których członkowie zawierają jednoniciowe DNA (ssDNA), dwuniciowe DNA (dsDNA) i genotypy RNA 4-9. Obecne protokoły budowy bibliotek stosowane do badania wirusów środowiskowych zawierających DNA lub RNA wymagają wstępnego traktowania nukleazą w celu usunięcia niedocelowych matryc 10. Jednak kompleksowe zrozumienie zbiorowego dopełnienia genów społeczności wirusów i różnorodności wirusów wymaga wiedzy wszystkich członków, niezależnie od składu genomu. Frakcjonowanie oczyszczonych podtypów kwasów nukleinowych zapewnia skuteczny mechanizm badania zbiorowisk wirusów bez poświęcania podzbioru sygnatury genetycznej społeczności.

Hydroksyapatyt, krystaliczna forma fosforanu wapnia, jest stosowany do rozdzielania kwasów nukleinowych, a także białek i mikrobów, od lat 60.11. Wykorzystując oddziaływanie ładunku między dodatnio naładowanymi jonami Ca2+ hydroksyapatytu a ujemnie naładowanym szkieletem fosforanowym podtypów kwasów nukleinowych, możliwe jest preferencyjne elucję każdego podtypu kwasu nukleinowego niezależnie od pozostałych. Niedawno zastosowaliśmy tę strategię do niezależnego frakcjonowania genomów wirusów zawierających ssDNA, dsDNA i RNA w ramach przygotowywania sekwencjonowania DNA 12. W tym miejscu przedstawiono metodę frakcjonowania i odzysku wirusowych kwasów nukleinowych ssDNA, dsDNA i RNA z mieszanych zespołów wirusowych za pomocą chromotografii hydroksyapatytowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów

Przed przeprowadzeniem chromatografii hydroksyapatytowej, fosforanowe muszą być przygotowane, a hydroksyapatyt musi być odpowiednio uwodniony.

  1. 1M roztwór fosforanu, pH 6,8: W kolbie o pojemności 1 l rozpuść 119,98 g monozasadowego fosforanu sodu w 1 l sterylnego H2O poddanego działaniu DEPC. Przygotować 1M dwuzasadowy roztwór fosforanu sodu w kolbie o pojemności 1 l, rozpuszczając 141,96 g dwuzasadowego fosforanu sodu w 1 l sterylnegoH2O poddanego działaniu DEPC. Połączyć roztwory mono- i di- w stosunku 1:1. Umieścić kolbę na płytce mieszającej i wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego. Dostosuj pH do 6,8, dodając wodorotlenek sodu (w celu zwiększenia pH) lub kwas fosforowy (w celu obniżenia pH).
  2. Bufor fosforanowy 0,12 M: W kolbie o pojemności 500 ml wymieszaj 30 ml 1 M roztworu fosforanu o pH 6,8, 2,5 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 5 ml 0,5 M EDTA. Dodaj sterylny, nasączony DEPC H2O do objętości 225 ml. Dostosuj pH do 6,8. Dodaj sterylny, poddanych działaniu DEPC H2O do 250 ml. Autoklaw.
  3. Bufor fosforanowy 0,18 M: W kolbie o pojemności 500 ml wymieszaj 45 ml 1 M roztworu fosforanu o pH 6,8, 2,5 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 5 ml 0,5 M EDTA. Dodać sterylny, nasączony DEPC H2O do objętości 225 ml. Dostosuj pH do 6,8. Dodaj sterylny, nasączony DEPC H2O do 250 ml. Autoklaw.
  4. Bufor fosforanowy 0,20 M: W kolbie o pojemności 500 ml wymieszaj 50 ml 1 M roztworu fosforanu o pH 6,8, 2,5 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 5 ml 0,5 M EDTA. Dodać sterylny, nasączony DEPC H2O do objętości 225 ml. Dostosuj pH do 6,8. Dodaj sterylny, nasączony DEPC H2O do 250 ml. Autoklaw.
  5. 0,40 M bufor fosforanowy: w kolbie o pojemności 500 ml wymieszaj 100 ml 1M roztworu fosforanu o pH 6,8, 2,5 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 5 ml 0,5 M EDTA. Dodać sterylny, nasączony DEPC H2O do objętości 225 ml. Dostosuj pH do 6,8. Dodaj sterylny, nasączony DEPC H2O do 250 ml. Autoklaw.
  6. "1,00 M bufor fosforanowy" (rzeczywiste stężenie fosforanu w tym roztworze wynosi 0,91 M): W kolbie o pojemności 500 ml wymieszaj 30 ml 1 M roztworu fosforanu o pH 6,8, 2,5 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 5 ml 0,5 M EDTA. Dodaj sterylny, nasączony DEPC H2O do objętości 225 ml. Dostosuj pH do 6,8. Dodaj sterylny, nasączony DEPC H2O do 250 ml. Autoklaw.
  7. Hydroksyapatyt: Odważ 1 g hydroksyapatytu i dodaj do tubki o pojemności 50 ml. Dodać 6 ml 0,12M buforu fosforanowego do hydroksyapatytu i odwrócić do mieszania. Przed użyciem rozgrzać do 60°C i dokładnie wymieszać. Przechowywać przez dłuższy czas w temperaturze 4°C.
  8. Przed użyciem należy zrównoważyć wszystkie fosforanowe i uwodniony hydroksyapatyt w temperaturze 60°C.

2. Przygotowanie kolumny ekonomicznej

  1. Zamknij kurek. Przepłukać kolumnę kilkakrotnie dejonizowanymH2O, wielokrotnie odwracając kolumnę i dekantując.
  2. Wyjmij kran z kolumny Econo i przeprowadź autoklaw kolumny w celu sterylizacji.
  3. Wymień i zamknij kurek. Dodaj 1 ml Sigmacote do sterylnej kolumny Econo-Column i pokryj wszystkie szklane powierzchnie. Otworzyć zawór odcinający i zdekantować.
  4. Podłącz kolumnę do łaźni wodnej obiegowej i ustaw temperaturę na 60°C. Aby zapewnić jak najmniejsze straty ciepła w całej kolumnie, zaleca się owinięcie kolumny środkiem izolacyjnym, takim jak folia aluminiowa lub pianka, izolacja rur.
  5. Przepłukać ekonomiczną kolumnę dwukrotnie sterylnym, wolnym od RNazH2O, a następnie dwukrotnie sterylnym, wolnym od RNaz buforem fosforanowym 0,12M.

3. Chromatografia hydroksypaptytu

  1. Upewniając się, że kran jest zamknięty, powoli dodać 2 ml wstępnie przygotowanego, ponownie zawieszonego hydroksyapatytu na dno kolumny Econo, używając sterylnej pipety serologicznej o pojemności 2 ml.
  2. Pozwól hydroksyapatytowi osiąść pod wpływem siły grawitacji przez 30 minut.
  3. Spuść bufor z kolumny i zamknij kurek. Połączyć kwasy nukleinowe z 0,12M buforem fosforanowym w końcowej objętości 500 μl i inkubować w temperaturze 60°C przez 10 minut w bloku grzewczym lub łaźni wodnej.
  4. Kwasy nukleinowe przygotowane w buforze fosforanowym 0,12M należy szybko nanieść na hydroksyapatyt za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml, uważając, aby nie naruszyć pracy kolumny.
  5. Pozwól kwasom nukleinowym związać się z hydroksyapatytem przez 30 minut.
  6. Umieść probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną, otwórz kran i zbierz początkową próbkę zawierającą ssDNA. Zamknij kurek.
  7. Dodaj 6 ml 0,12M buforu fosforanowego do hydroksyapatytu, uważając, aby nie naruszyć kolumny, otwórz kran i zbierz jednoniciowe DNA w probówce 15 ml z poprzedniego kroku. Zamknij kurek.
  8. Dodać 1 objętość roztworu fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:25:1 v/v/v) do probówki, energicznie wymieszać i odwirować przy 3500 x g przez 15 minut. Przenieść supernatant zawierający ssDNA do nowej probówki o pojemności 15 ml.
  9. Powtórzyć 3,76 i 3,87, używając 6 ml 0,20 M buforu fosforanowego do elucji i oczyszczenia RNA z kolumny, upewniając się, że używasz nowej probówki o pojemności 15 ml do zbierania.
  10. Powtórz 3,76 i 3,87, używając 6 ml 0,40 M buforu fosforanowego do elucji i oczyszczenia dsDNA z kolumny, upewniając się, że używasz nowej probówki o pojemności 15 ml do pobrania.
  11. Powtórzyć 3,76 i 3,87, używając 6 ml 1,00 M buforu fosforanowego, aby usunąć kolumnę z wszelkich pozostałości dsDNA, upewniając się, że używasz nowej probówki o pojemności 15 ml do pobrania.

4. Odsalanie próbek kwasów nukleinowych

  1. Przenieś 4-5 ml próbki do filtra odśrodkowego Amicon Ultra-4 wyposażonego w membranę Ultracel o masie cząsteczkowej 30 000.
  2. Zagęścić próbkę do < 500 μl, wirując w temperaturze 6 000 x g, w temperaturze 30°C, 5 minut (lub do momentu uzyskania skoncentrowanej objętości) w wirniku o stałym kącie nachylenia. Odrzuć przepływ.
  3. Dodaj pozostałą część próbki (próbek) do filtra odśrodkowego Amicon Ultra-4 i zwiększ objętość do 4-5 ml za pomocą wolnego od Rnazy buforu 1X TE.
  4. Zagęścić próbkę do < 500 μl, wirując w temperaturze 6 000 x g, w temperaturze 30°C, 5 minut (lub do momentu uzyskania skoncentrowanej objętości) w wirniku o stałym kącie. Odrzuć przepływ.
  5. Dodaj 4-5 ml wolnego od rnaz buforu 1X TE do filtra odśrodkowego Amicon Ultra-4. Zagęścić próbkę do < 500 μl przez odwirowanie w temperaturze 6 000 x g, 30°C, 5 minut (lub do momentu uzyskania skoncentrowanej objętości) w wirniku o stałym kącie. Odrzuć przepływ.
  6. Powtórzyć krok 4.5 dodatkowo 5 razy, aby całkowicie odsolić próbkę(i) kwasu nukleinowego.
  7. Przenieś pozostałą próbkę (próbki) do sterylnej probówki eppendorfa o pojemności 1,7 ml. Dodaj 1/10 objętości octanu sodu 3M o pH 7,0, dwie objętości 100% etanolu i 1 μl Glycoblue. Dobrze wymieszaj, wirując.
  8. Odwirować w temperaturze 28 000 x g, 4°C, 60 minut. Dekantuj, uważając, aby nie naruszyć pelletu. Dodaj 300 μl 70% etanolu. Wirować w temperaturze 28 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zdekantować, wysuszyć i ponownie zawiesić każdą frakcję w odpowiedniej objętości buforu TE wolnego od rnazy.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1 podsumowuje przedstawione metody wykorzystania chromatografii hydroksyapatytowej do frakcjonowania kwasów nukleinowych ssDNA, dsDNA i RNA z mieszanego zespołu wirusów. Metoda ta wykorzystuje oddziaływanie ładunku między ujemnie naładowanym szkieletem fosforanowym kwasów nukleinowych a dodatnio naładowanymi jonami Ca2+ obecnymi w hydroksyapatycie i pozwala na efektywne frakcjonowanie podtypów kwasów nukleinowych (ssDNA, dsDNA i RNA) przy rosnących stężeniach fosforanowych 12.

Frakcjonowanie hydroksyapatytu w in vitro "społeczności" znanych genomów wirusa ssDNA (M13mp18), dsDNA (lambda) i RNA (MS2 i phi6) jest zilustrowane na rysunku 2. Kwasy nukleinowe połączono w równych stężeniach, nałożono na kolumnę hydroksyapatytu i eluowano przy użyciu buforu fosforanowego o rosnącym stężeniu. Każdy podtyp kwasu nukleinowego eluuje niezależnie od innych z mniej niż 9% przeniesieniem z jednej frakcji do drugiej.

Zastosowanie tej techniki do kwasów nukleinowych wyizolowanych ze społeczności wirusów zebranych w Zatoce Chesapeake pokazano na rysunku 3. Całkowity uzysk kwasu nukleinowego wyizolowanego z oczyszczonych wirusów zastosowano do kolumny hydroksyapatytowej. Materiał genomowy składający się z ssDNA, RNA i dsDNA został niezależnie eluowany odpowiednio o stężeniach 0,12M, 0,20M i 0,40M/1,00M buforu fosforanowego. Dwuniciowy DNA jest eluowany przy stężeniach fosforanów 0,40M i 1,00M i w tym przypadku dominuje w tej społeczności wirusowej w porównaniu z genotypami ssDNA i RNA. Obserwacja ta jest zgodna z oczekiwanym składem zbiorowisk wirusowych w środowiskach morskich i ujściach rzek, w których większość odzyskiwalnych kwasów nukleinowych to dsDNA 13.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schemat przepływu metody chromatografii hydroksyapatytowej do frakcjonowania kwasów nukleinowych. Mieszaninę ssDNA, dsDNA i RNA przygotowaną w 0,12M buforze fosforanowym podgrzewa się do temperatury 60°C i nakłada na kolumnę hydroksyapatytową utrzymywaną w stałej temperaturze 60°C za pomocą krążącej łaźni wodnej. Kwasy nukleinowe (ssDNA, RNA i dsDNA) są eluowane z hydroksyapatytu przy rosnących stężeniach buforu zawierającego fosforany. Rysunek ten został odtworzony za zgodą Amerykańskiego Towarzystwa Mikrobiologii i pierwotnie pojawił się w Andrews-Pfannkoch et al. 201012.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Rozdzielanie znanych wirusowych kwasów nukleinowych za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej. Równe stężenia M13mp18 ssDNA, MS2 ssRNA, phi6 dsRNA i lambda dsDNA (odpowiednio pasy 2-5) połączono (tor 6) i nałożono na kolumnę hydroksyapatytu. Jednoniciowe DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6) i dsDNA (lambda) zostały niezależnie wymyte z kolumny hydroksyapatytu przy użyciu 0,12M (tor 8), 0,18M (tor 9) i 0,40M/1,00M (tor 10). Drabinka 1kb (pasy 1, 7) została użyta do potwierdzenia rozmiarów genomu. Rysunek ten został odtworzony za zgodą Amerykańskiego Towarzystwa Mikrobiologii i pierwotnie pojawił się w Andrews-Pfannkoch et al. 201012.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Separacja wirusowych kwasów nukleinowych wyizolowanych ze społeczności w Zatoce Chesapeake. Kwasy nukleinowe wyizolowano i nałożono na kolumnę hydroksyapatytową. ssDNA (pasmo 0,12 M), RNA (pasmo 0,20 M) i dsDNA (pasmo 0,40 M / 1,0 M) eluowano niezależnie przy użyciu stężeń buforu fosforanowego odpowiednio 0,12 M, 0,20 M i 0,40 M / 1,00 M. Drabinka DNA Hi Mass (ścieżka L1) i drabinka 1kb (ścieżka L2) zostały użyte do wizualnego potwierdzenia przybliżonej masy cząsteczkowej i masy kwasów nukleinowych. Rysunek ten został odtworzony za zgodą Amerykańskiego Towarzystwa Mikrobiologii i pierwotnie pojawił się w Andrews-Pfannkoch et al. 201012.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metodologia chromatografii hydroksyapatytowej jest wysoce wydajnym i solidnym narzędziem do frakcjonowania kwasów nukleinowych z mieszanych zespołów wirusów, gdy celem jest zbadanie całkowitego składu kwasów nukleinowych w społeczności. Ogólnie rzecz biorąc, ssDNA, RNA i dsDNA będą wymuwać z kolumny bufora fosforanowego stężenia większe niż odpowiednio około 0 i 0,40 M. Jednak każdy preparat hydroksyapatytu może mieć nieco inny skład i profil elucji, dlatego ważne jest, aby każdy preparat t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Biuro Nauki (BER), Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Umowa o współpracy nr. De-FC02-02ER63453, Program Sekwencjonowania Genomu Drobnoustrojowego Narodowej Fundacji Nauki (numery nagród 0626826 i 0731916). Dziękujemy Johnowi Glassowi za jego wiedzę techniczną i porady oraz K. Ericowi Wommackowi za pomoc w pobieraniu próbek środowiskowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Econo-ColumnBio-Rad737-07170,7cm pakiet ID/2
HydroksyapatytBio-Rad130-0520DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td>
Fosforan sodu, MonobasicVWR internationalVW1497-01Monohydrat, Kryształ 500g
Fosforan sodu, dwuzasadowyVWR internationalVW1496-01Bezwodny, Proszek 500g
Woda uzdatniona DEPCInvitrogenAM9922
1L 10% roztwór SDSInvitrogen24730-020UltraPure, 1L
0,5M EDTAInvitrogenAM9262pH 8,0, 1L
SigmacoteSigma-AldrichSL2-25ML
2ml pipeta serologicznaVWR international89130-884Polistyren, sterylne
probówki wirówkowe BD FalconVWR international21008-93615ml, sterylne
fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1 v/v/v)Invitrogen15593-031UltraPure, 100ml
Amicon Ultra-4 Urządzenie odśrodkoweEMD MilliporeUFC803024Membrana Ultracel-30
20X TE Bufor bez rnazyInvitrogenT11493100ml
GlycoblueInvitrogenAM951615mg/ml

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
  2. Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).
  3. Weinbauer, M. G. Bacteriophages: Evolution of the Majority. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).
  4. Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes. Nature. 455, 830-830 (2008).
  5. McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression. PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).
  6. Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples. PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).
  7. Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. RNA Viruses in the Sea. FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).
  8. Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics. J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).
  9. Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics. J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).
  10. Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities. Science. 312, 1795-1795 (2006).
  11. Bernardi, G. Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite. Nature. 209, 779-779 (1965).
  12. Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages. Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).
  13. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nucleic Acid SeparationViral Nucleic AcidsPhosphate Buffer ElutionRNA VirusesNucleic Acid DesaltingGel Electrophoresis

Powiązane artykuły