$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Pobranie i dysocjacja komórek guza neuroendokrynnego jelita cienkiego (SBNET) i dysocjacja komórek
- Uzyskaj wycięte próbki SBNET pacjenta po potwierdzeniu tkanki nowotworowej z rdzenia patologii chirurgicznej.
- Pokrój SBNETy w kostkę o średnicy 5 mm i przechowuj je w 25 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM)/F12 firmy Dulbecco w stożkowej probówce do transportu do laboratorium.
- Przenieś guzy do DMEM zawierającego 1% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS, 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) i 1% glutaminy (pożywki do mycia) i inkubuj w tym pożywce do mycia przez 15 minut.
- Przenieś guzy do nowego naczynia i zmiel je na kawałki o średnicy mniejszej niż 1 mm za pomocą sterylnych zakrzywionych nożyczek.
- Przenieść zmielone tkanki do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu do mycia.
- Odwirować próbkę w temperaturze 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 10 ml pożywki płuczącej zawierającej kolagenazę (100 U/ml) i DNazę (0,1 mg/ml).
- Pozostawić rozdrobnione guzy do trawienia w inkubatorze o temperaturze 37 °C z powolnym wstrząsaniem (50 obr./min) przez 1,5 godziny.
2. Hodowla SBNET jako sferoid guza w macierzy pozakomórkowej (ECM)
- Po zakończeniu trawienia (krok 1.8) odwirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 ml pożywki do mycia.
- Umieść sitko o pojemności 70 μm na nowej probówce o pojemności 50 ml i przenieś 10 ml pożywki myjącej na sitko do komórek. Zakręć medium myjącym, aby przykryć bok plastikowej rurki, aby zapobiec przywieraniu komórek NET do boku plastikowej rurki.
- Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko do komórek.
- Wirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 200 μl pożywki płuczącej (całkowita objętość wynosi ~ 250 μL) i umieścić go na lodzie.
- Przenieść 5 μl komórek do 500 μl pożywki płuczącej (współczynnik rozcieńczenia 1/100). Użyj rozcieńczonych komórek do zliczania komórek za pomocą hemocytometru, aby uzyskać liczbę komórek na mililitr. Pomnóż przez 100, aby skorygować współczynnik rozcieńczenia.
- Pomnóż liczbę komórek na ml otrzymaną w kroku 2.5 przez całkowitą objętość komórek w zawiesinie otrzymaną w kroku 2.4 (~ 250 μL).
- Wirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w płynnym ECM (1 x 106 komórek/ml) i przechowywać na lodzie.
- Przenieś 5-20 μl sferoid SBNET w ECM na 96-dołkową płytkę i pozwól ciekłemu ECM zestalić się, umieszczając płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.
- Dodaj 200 μl pożywki hodowlanej SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutaminy + 10 mM nikotynamidu + 10 μg/ml insuliny) do każdego dołka płytki 96-dołkowej zawierające sferoidy SBNET w ECM.
- Alternatywnie, hoduj organoidy SBNET w pożywkach z komórek macierzystych podobne do tego, co zostało wcześniej opisane dla hodowli organoidów ludzkiej wątroby lub trzustki i wymienione w Tabeli materiałów.
- Zmieniaj nośniki co 5-7 dni.
3. Charakterystyka sferoid SBNETS za pomocą immunofluorescencji
- Przenieś organoidy wyhodowane w ECM do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety P1000.
- Wirować przy 1,500 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.
- Przemyć kulturę organoidów, dodając 1 ml soli fizjologicznej w postaci buforu fosforanowego lub PBS, wymieszać, odwirować przy 1 500 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.
- Utrwal organoidy, dodając 500 μl 4% paraformaldehydu i inkubuj przez 15 minut.
- Umyj kulturę dwukrotnie 1 ml PBS.
- Uzdatniaj kulturę, dodając 500 μl PBS + 3% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA + 0,1% Triton X 100 przez 5 minut.
- Następnie przemyj trzykrotnie 1 ml PBS + 3% BSA.
- Inkubować przez 1 godzinę z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko synaptofizynie (SYP) w rozcieńczeniu 1:600 lub chromograninie A (CgA) i receptorowi somatostatyny 2 (SSTR2) w rozcieńczeniu 1:400 w buforze przeciwciał (2,5% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% azydku sodu, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM chlorku sodu).
UWAGA: Użyj 300 μl lub więcej roztworu przeciwciał na probówkę. - Umyj trzy razy 1 ml PBS + 3% BSA.
- Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z FITC w rozcieńczeniu 1:500 w buforze przeciwciał przez 1 godzinę. Użyj 300 μl lub więcej roztworu przeciwciał na probówkę.
- Umyj 3 razy 1 ml PBS + 3% BSA. Upewnij się, że odessałeś i odrzuciłeś cały supernatant.
- Dodać 5 μl podłoża montażowego zawierającego barwnik jądrowy DAPI.
- Za pomocą pipety P20 przenieś 5 μl sferoidów SBNET z kroku 4.12 na szkiełko podstawowe i uszczelnij szkiełkiem przykrywkowym.
- Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu obiektywów 10x, 20x lub 40x.