Opracowanie eksperymentalnego modelu tętniaka u królika przy użyciu torebki naczyniowej nasączonej elastazą

Streszczenie

Źródło: Wanderer, S., i inni. Model tętniaka mikrochirurgicznego bifurkacji u królika. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje tworzenie eksperymentalnego modelu tętniaka u królika przy użyciu torebki naczyniowej poddanej elastazie. Po wycięciu fragmentu prawego CCA, worek jest traktowany elastazą, a następnie zszywany do lewego CCA w celu przywrócenia przepływu krwi. Powstałe naprężenia na osłabionych ściankach worka indukują powstawanie tętniaka.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

UWAGA: Trzymaj wszystkie zwierzęta w temperaturze pokojowej 22\u201224 Celsjusza (°C) i utrzymuj 12-godzinny (h) cykl światła/ciemności. Za każdym razem zapewnij bezpłatny dostęp do wody, pelletu i diety z siana ad libitum. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą nieparametrycznego testu Wilcoxona-Manna-Whitneya-U. Wartość prawdopodobieństwa (p) wynosząca ≤ 0,05 została uznana za istotną.

1. Faza przedoperacyjna

1. Wykonaj szczegółowe przedoperacyjne badanie kliniczne wszystkich królików planowanych do operacji bezpośrednio obok cichej, aseptycznej sali operacyjnej, utrzymując temperaturę 23 ± 3 °C.
   1. Zapisz makroskopowo masę ciała każdego zwierzęcia i oceń błony śluzowe, czas napełniania kapilar i jakość impulsu.
   2. Następnie wykonaj osłuchiwanie serca stetoskopem i badanie palpacyjne jamy brzusznej.
   3. Opierając się na wynikach klinicznych, przypisz klasyfikację Amerykańskiego Towarzystwa Anestezjologów (ASA) każdemu królikowi19. Do badania należy włączyć wyłącznie zwierzęta z wynikiem ASA I.
   4. Ogol oba uszy zewnętrzne golarką elektryczną i nałóż krem prylokainowo-lidokainowy na obie tętnice uszne i żyły.
2. Uspokoić królika kombinacją 20 miligramów (mg)/kilogram (kg) ketaminy, 100 mg/kg deksmedetomidyny i 0,3 mg/kg metadonu wstrzykiwanego podskórnie (SC) za pomocą strzykawki.
3. Pozostaw każde zwierzę w spokoju przez co najmniej 15 minut.
4. Następnie, pod dodatkowym natlenieniem z 3 litrami (l) / minutę (min) przez luźną maskę na twarz i stałym monitorowaniem za pomocą pulsoksymetru, umieść kaniulę 22 G w lewej tętnicy środkowej małżowiny usznej i kolejną kaniulę 22 G w żyle usznej ucha przeciwległego.
5. Ogolić pole operacyjne (szyję) i śródskórnie wstrzyknąć 0,75% ropiwakainy okołonacięciowej. Następnie ogol czoło i przygotuj się do umieszczenia pediatrycznych czujników elektroencefalograficznych (EEG).
6. Wywołać znieczulenie ogólne propofolem w dawce 1-2 mg/kg dożylnie (IV) w celu uzyskania efektu. Następnie należy natychmiast zaintubować tchawicę wszystkich królików za pomocą silikonowej rurki (3 milimetry (mm) średnicy wewnętrznej) pod kontrolą kapnograficzną. Następnie przetransportuj wszystkie króliki na salę operacyjną, umieść je w pozycji leżącej grzbietowej i podłącz rurkę do systemu koła pediatrycznego.
7. Osiągnij pogłębienie i utrzymanie znieczulenia dzięki izofluranowi w tlenie, dążąc do maksymalnego stężenia izofluranu w końcówce oddechu wynoszącego 1,3%.
8. Zapewnić monitorowanie kliniczne i instrumentalne (pulsoksymetria, doppler i inwazyjne ciśnienie krwi, elektrokardiogram 3-odprowadzeniowy, EEG, monitorowanie temperatury w odbycie oraz gazy wdychane i wydychane) do momentu ekstubacji tchawicy.
9. Aby utrzymać nawodnienie, mleczan Ringera jest dostarczany w infuzji z ciągłą szybkością (CRI) 5 ml/kg/h przez dostęp żylny. Zawsze potwierdzaj prawidłowe znieczulenie za pomocą szczypania palców u nóg w odstępie 10 minut.
10. Zdezynfekuj pole operacyjne za pomocą jodu powidonu od nasady piersiowej do obu kątów żuchwy. Teraz wykonaj sterylne obłożenie pola operacyjnego.
11. Podczas zabiegu należy podać środek przeciwbólowy z lidokainą o współczynniku CRI 50 mikrogramów (μg)/kg/min oraz fentanylem o wartości 3–10 μg/kg/h. Zastosuj wentylację spontaniczną lub wspomaganą, a także permisywną hiperkapnię. Wykonaj analizę gazometrii krwi tętniczej co najmniej raz podczas operacji.
12. Odpowiednie niedociśnienie tętnicze (średnie ciśnienie tętnicze < 60 mmHg) należy leczyć noradrenaliną. Zapobiegaj hipotermii (temperatura w odbycie ≤ 38 °C) za pomocą poduszki grzewczej lub systemu ogrzewania z wymuszonym obiegiem powietrza.

2. Faza chirurgiczna – Krok I

1. Rozpocznij operację od środkowego nacięcia skóry od brzucha mostka do poziomu kątów żuchwy/krtani. Ostro wypreparuj skórę i tkanki miękkie skalpelem, nożyczkami chirurgicznymi i kleszczami. Oddziel tkankę podskórną i poduszeczkę tłuszczową przyśrodkowo przez tępe rozwarstwienie.
2. Wejdź do przedniego górnego grzbietu mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego przyśrodkowo po lewej stronie przez tępe rozwarstwienie za pomocą mikrokleszczy i nożyczek chirurgicznych.
3. Makroskopowo wykonaj tępe przygotowanie i ostrożnie oddziel lewe CCA od nerwu błędnego dystalnie, aby uniknąć niedowładu krtani, dalej używając mikrokleszczy i nożyczek chirurgicznych (Rysunek 1). Zauważ, że rozwidlenie lewego CCA służy jako śródoperacyjny punkt orientacyjny (Rysunek 2 i Rysunek 3A). Do wszystkich poniższych kroków użyj rozsiewacza tkanek miękkich, aby poprawić wizualizację chirurgiczną.
4. Po pomyślnym opracowaniu i uwolnieniu lewego dystalnego CCA z nerwu błędnego, papawerynę (40 mg/ml, 1:1 rozcieńczoną w 0,9% izotonicznym roztworze chlorku sodu) należy podawać miejscowo. Stale chroń wszystkie segmenty naczyń za pomocą mikrowacików, a następnie podawaj dalej papawerynę zewnętrznie. Umieść nasączone papaweryną lewe CCA poniżej autologicznej tkanki mięśniowej, aby chronić naczynie przed wysychaniem pod światłem mikroskopu operacyjnego.
5. Zmieniaj strony, maksymalizując komfort chirurga podczas zabiegu operacyjnego. Powtórz tę samą procedurę chirurgiczną po prawej stronie. Rozwiń CCA dystalnie i proksymalnie aż do predefiniowanych punktów orientacyjnych (rozwidlenie tętnicy szyjnej na poziomie kątów żuchwy/krtani i żyły szyjnej wewnętrznej; Rysunek 3A,B). Ponownie włóż rozsiewacz i podaj mikrowaciki i papawerynę, jak opisano wcześniej.
6. Przed podwiązaniem prawego proksymalnego CCA należy wstrzyknąć heparynę (500 jednostek międzynarodowych (j.m.)/kg) ogólnoustrojowo przez cewnik do ucha dożylnego.
7. Od teraz korzystaj z mikroskopu chirurgicznego. Najpierw podwiąż prawe proksymalne CCA za pomocą niewchłanialnego szwu 4-0 bezpośrednio na końcu makroskopowo widocznego proksymalnego punktu orientacyjnego, aby uniknąć napięcia w naczyniu tętniczym.
   1. Po drugie, należy zastosować niewchłanialną ligaturę 6-0 dokładnie 4\u20125 mm dystalnie, używając klipsa do naczynia do pomiaru, biorąc pod uwagę, że po przecięciu dystalnie z pierwszej ligatury 4-0 powstały worek tętniczy będzie miał standardową długość około 3\u20124 mm u każdego zwierzęcia (Rysunek 4A,C).
8. Po zaciśnięciu ligatury 6-0, zaciśnij prawe CCA tak daleko, jak to możliwe, za pomocą tymczasowego klipsa do naczynia (zwykle stosowanego w chirurgii tętniaka mózgu), aby uniknąć uszkodzenia śródbłonka i utworzyć długi segment naczynia do irygacji, aby zapobiec trombogenezie (Rysunek 4B).
9. Teraz wykonaj cięcie dystalnie do ligatury niewchłanialnej 4-0. Aby pobrać worek tętniczy (Rysunek 4C), wykonaj drugie cięcie dystalnie do niewchłanialnej ligatury 6-0.
10. Dokładnie oczyść worek tętniczy z całej tkanki miękkiej i zmierz jego długość, szerokość i głębokość (Rysunek 4C) za pomocą klipsa do naczynia. Jeśli dalsza modyfikacja nie jest konieczna, należy przechowywać autologiczny przeszczep tętniczy w roztworze heparynizowanym (500 j.m./100 ml w 0,9% izotonicznym chlorku sodu) w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia.

3. Degradacja worka tętniczego

1. Jeśli potrzebna jest degradacja worka tętniczego, należy go dokładnie oczyścić z tkanek miękkich i wstępnie inkubować ze 100 j.m. elastazy świńskiej rozpuszczonej w 5 ml buforu Tris w temperaturze pokojowej w dniu doświadczenia przez 20 min. Nie używaj techniki pędzla. Inkubować worek tętniczy w świetle i na zewnątrz za pomocą wytrząsarki.
2. Przed umieszczeniem saszetki w heparynizowanym roztworze 0,9% izotonicznego chlorku sodu delikatnie przetrzyj ją trzy razy przez 3 minuty anatomicznymi kleszczami w 0,9% izotonicznym roztworze chlorku sodu, aby wypłukać pozostałą elastazę świńską.
3. W razie potrzeby utrzymuj światło torebki tętniczej otwarte za pomocą mikrorurki wykonanej z silikonu; skrupulatnie chroń lewe i prawe CCA podczas całego zabiegu chirurgicznego za pomocą mokrych mikrowyściółki.

4. Faza chirurgiczna – Krok II

1. W celu dalszego przygotowania CCA umieść dwa okrągłe mikrowaciki bezpośrednio pod nim, aby przesunąć tętnicę bardziej powierzchownie. Teraz umieść jeden mikrowacik z fioletową wyściółką pod lewym CCA w dystalnej trzeciej części, aby uzyskać lepszą wizualizację tętnicy.
2. Przepłukać prawe proksymalne CCA roztworem 0,9% izotonicznego chlorku sodu w połączeniu z 500 j.m. heparyny rozpuszczonej w 100 ml 0,9% izotonicznego chlorku sodu. W celu stworzenia zespolenia bez napięć, umieść prawe CCA pod poduszką tłuszczową/mięśniem okołotchawiczym, używając nożyczek chirurgicznych, aby tunelować je na lewą stronę. Usuń tkankę miękką tętnicy.
   1. Teraz wykonaj 2 mm nacięcie pyska ryby po bliższej stronie prawego CCA za pomocą mikronożyczek i kleszczy.
3. Zmień stronę na stole operacyjnym. Przytnij lewy dystalny CCA innym tymczasowym klipsem naczynia, a następnie bliższym lewym CCA dwoma tymczasowymi klipsami naczyń. Chroń wszystkie odsłonięte segmenty naczyń przed wysychaniem pod wpływem światła chirurgicznego za pomocą mokrych mikrowacików.
4. Całkowicie uwolnij dystalną trzecią część lewego CCA z tkanek miękkich i wykonaj arteriotomię. Użyj mikrokleszczy chirurgicznych i delikatnie chwyć trochę tkanki miękkiej. Teraz podnieś tętnicę i powoli nacinaj lewą dystalną CCA za pomocą mikroskopu chirurgicznego. Przepłukać segmenty naczynia heparyną (500 j.m. rozpuszczoną w 100 ml 0,9% izotonicznego roztworu chlorku sodu).
5. Po wykonaniu arteriotomii za pomocą zakrzywionych mikrokleszczyków i mikronożyczek należy powiększyć arteriotomię znajdującą się w dystalnej trzeciej części lewej dystalnej części CCA, mierzącą około 2-krotność średnicy prawego tępego tętnicy szyjnej i przeszczepu autologicznego. Umożliwia to wystarczający przepływ krwi do worka tętniczego.
6. Wyjąć worek tętniczy z roztworu soli fizjologicznej podgrzanej heparyną. Umieść worek w polu operacyjnym, gdzie planowane jest rozwidlenie. Rozpocznij zszywanie tylnej części prawej tętnicy szyjnej tępej doogonowo za pomocą niewchłanialnego szwu 9-0, a następnie szwu na tylnej stronie czaszki na poziomie nacięcia w pysku ryby. Zakończ szycie tyłu od dystalnej do bliższej za pomocą pojedynczych szwów.
7. Podczas szycia utrzymuj wszystkie woreczki z preinkubowaną elastazą w stanie wilgotnym przy ciągłym nawadnianiu. Podczas zszywania ściany naczynia worka użyj zakrzywionych mikrokleszczyków chirurgicznych, aby delikatnie otworzyć światło końcówką. Podczas szycia części lewego lub bliższego prawego CCA należy używać prostych mikrokleszczy chirurgicznych. Następnie zszyj poziomą tylną stronę.
8. Następnie zszyj poziomą przednią stronę, zaczynając od kopuły tętniaka, przechodząc do jego podstawy. Następnie zacznij od pojedynczych ściegów dystalnie z przodu, poruszając się doogonowo.
   1. Dla wszystkich etapów 4.5\u20124.8 podczas szycia zespolenia należy zwrócić uwagę, aby chwycić tylko część naczynia w pobliżu arteriotomii, aby uniknąć zwężenia jatrogennego. Ponadto należy w sposób ciągły nawilżać wszystkie segmenty naczyń podczas całego zabiegu chirurgicznego zewnątrzświetlistko za pomocą strzykawki wypełnionej heparynizowanym roztworem chlorku sodu (500 IU rozpuszczonego w 100 ml 0,9% izotonicznego chlorku sodu) i chronić je mokrymi mikrowacikami.
   2. Przed zakończeniem zespolenia należy przepłukać cały kompleks heparynizowanym 0,9% izotonicznym roztworem chlorku sodu śródświetlnego (500 j.m. rozpuszczonego w 100 ml 0,9% izotonicznego chlorku sodu). Należy pamiętać, że worki tętnicze modyfikowane elastazą muszą być przyszyte tak szybko, jak to możliwe, ze względu na ich silną tendencję do wysychania i zakrzepienia. Ze względu na agresywne zachowanie resztkowego stężenia elastazy w torebce w odniesieniu do trawienia naczyń obwodowych, należy szybko przystąpić do operacji, aby szybko ponownie perfuzji kompleksu naczyń.
9. Usuń wszystkie tymczasowe zaciski naczyniowe stopniowo.
   1. Usuń dystalny zacisk z lewego CCA. Zaakceptuj niewielkie krwawienie i zatamuj je, delikatnie odciskając mikrowaciki na zespoleniu. Następnie zdejmij zacisk prawego CCA, delikatnie dociśnij mikrowacikiem i kleszkami, aby uniknąć tworzenia się skrzepliny.
   2. W razie potrzeby wymień tymczasowe klipsy naczyniowe, aby zapewnić wystarczającą ilość krzepnięcia. Następnie odciąż oba klipsy naczyń z lewej strony proksymalnie. W razie potrzeby na dowolnym etapie wymień klipsy, aby umożliwić koagulację lub ponowne zszycie.
10. Na tym etapie należy wykonać angiografię fluorescencyjną kompleksu naczyń krwionośnych (Ryc. 5)
    UWAGA: Angiografię fluorescencyjną wykonuje się poprzez podanie 1 ml fluoresceiny dożylnej przy użyciu 2 filtrów pasmowo-przepustowych, smartfona z kamerą wideo i reflektora rowerowego. Procedura ta została już opisana w innym miejscu20,21,22.
11. Na koniec zamknij miejsce operacyjne. Ponownie dostosuj i delikatnie zszyj poduszeczkę tłuszczową za pomocą szwu wchłanialnego 3-0 z pojedynczymi węzłami, aby chronić zespolenie. Zamknij tkankę podskórną i skórę w ten sam sposób.

5. Faza pooperacyjna

1. Należy przerwać podawanie izofluranu i ogólnoustrojowego środka przeciwbólowego pod koniec operacji i przeprowadzić ekstubację tchawicy, gdy tylko powróci odruch połykania.
2. Podawać 0,5 mg/kg meloksykamu dożylnie, 10 mg/kg aspiryny (ASS) dożylnie, 100 μg witaminy B12 SC i 20 mg/kg klaksylu dożylnie.
3. Zapewnij dodatkowe natlenienie i aktywne ogrzewanie, aż króliki spontanicznie odzyskają pozycję leżącą mostka.
4. Wykonuj obserwację pooperacyjną i opiekę nad zwierzętami cztery razy dziennie przez pierwsze trzy dni zgodnie z wytycznymi dotyczącymi oceny i leczenia bólu u gryzoni i królików23,24.
5. Analgezję pooperacyjną należy podawać za pomocą plastra z fentanylem (12 μg/h) nakładanego na ucho zewnętrzne, meloksykamu raz dziennie podchorzalnie przez trzy dni i metadonu jako terapii ratunkowej SC, zgodnie z arkuszem wyników do oceny bólu. Wszystkim królikom podawać podskórnie 250 j.m./kg niskocząsteczkowej heparyny (LMH) przez trzy dni.

Wyniki

Rysunek 1: Wstępny etap operacyjny.

Początkowy etap operacyjny, przedstawiający lewą tętnicę szyjną (biała strzałka), nerw błędny (czarna strzałka) (A) oraz ostrożne oddzielenie lewej tętnicy szyjnej od nerwu błędnego dystalnie, aby uniknąć niedowładu krtani.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-0 szew resorbowalny	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 szew niewchłanialny	B. Braun, Niemcy	G0762563
6-0 niewchłanialny szew	B. Braun, Niemcy	C0766070
9-0 szew niewchłanialny	B. Braun, Niemcy	G1111140
Adrenaline	Amino AG	1445419	any generic
Amiodarone	Helvepharm AG	5078567	wszelkie ogólne
Aparat anestezjologiczny	Dräger		any other
Aspiryna	Sanofi-Aventis (Szwajcaria) SA	622693	any generic
Atropine	Labatec Pharma SA	6577083	any generic
Filtr pasmowoprzepustowy niebieski	Thorlabs	FD1B	any
Filtr pasmowoprzepustowy zielony	Thorlabs	FGV9	any other
Kleszcze			any other
Reflektor			dowolny inny
Klips do naczynia Biemer (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Szwajcaria	FD560R	temporary
Indeks dwuspektralny (noworodkowy)			dowolny inny
Mankiet do pomiaru ciśnienia krwi (noworodkowy)			dowolny inny
Clamoxyl	GlaxoSmithKline AG	758808	any generic
Dexmedetomidine	Ever Pharma	136740-1	any generic
Elektrody			any other
Elastase	Sigma Aldrich	45125	any generic
Ephedrine	Amino AG	1435734	dowolny ogólny
Esmolol	OrPha Swiss GmbH	3284044	any generic
Fentanyl (podanie dożylne)	Janssen-Cilag AG	98683	any generic
Fentanyl (transdermalny)	Mepha Pharma AG	4008286	dowolny ogólny
Fluoresceine	Curatis AG		5030376 any generic
Fragmin	Pfizer PFE Switzerland GmbH	1906725	any generic
Glyco			any generic
Poduszka			grzewczadowolny inny
Izotoniczny roztwór chlorku sodu (0,9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Ketamina	Pfizer	342261	any generic
Wytrząsarka laboratoryjna	Stuart	SRT6	dowolna inna
Lidokaina	Streuli Pharma AG	747466	any generic
Longuettes			any other
Metacam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Methadone	Streuli Pharma AG	1084546	dowolny ogólny
Mikrorurki			dowolne inne
Uchwyt			dowolny inny
Midazolam	Accord Healthcare AG	7752484	dowolny ogólny<
		dowolny inny
O2-Maska			na twarz dowolna inna
Mikroskop operacyjny	Wild Heerbrugg		any other
Papaverine	Bichsel		dowolny ogólny
Prilocaine-lidokaina crème	Emla		dowolny ogólny
Propofol	B. Braun Medical AG, Szwajcaria		any generic
Pulsoksymetr			dowolny ogólny
Sonda temperatury doodbytniczej (noworodkowa)			any other
Ropivacaine	Aspen Pharma Schweiz GmbH	1882249	any generic
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Golarka			dowolna inna
Smartphone			any other
Kleszczyki do tkanek miękkich			dowolny inny
Rozpórka			dowolna inna
Miski			dowolna inna
Sterylne mikrowaciki			dowolne inne
		dowolny inny
Proste i zakrzywione mikrokleszcze			dowolna inna
Proste i zakrzywione			dowolna inna
Proste i zakrzywione kleszcze			dowolna inna
Serweta	chirurgiczna		any other
Nożyczki			any inny
Strzykawki 1 ml, 2ml i 5 ml			dowolne inne
Tris-Buffer	Sigma Aldrich	93302	any generic
Aplikator klipsów naczyniowych	B. Braun, Niemcy	FT495T
Cewnik do żył i tętnic 22 G			dowolny ogólny
Vitarubin	Streuli Pharma AG		6847559 any generic
Yasargil titan standard clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Szwajcaria	FT242T	tymczasowy

other bipolarne rowerowy elektrokardiogramu na mikroigłę td style='wysokość:15.75pt;'>Uchwyt na igłę dla małych zwierząt do tkanek miękkich z gąbki ze stali nierdzewnej < td style='wysokość: 15,75 pkt;'>Stetoskop mikronożyczki chirurgiczne