Opracowanie modelu ciśnienia translaminarnego przy użyciu translaminarnego systemu autonomicznego

Streszczenie

Źródło: Sharma, T. P., i wsp., Translaminarny model autonomicznego systemu do modulacji ciśnienia wewnątrzgałkowego i śródczaszkowego w tylnych segmentach dawcy ludzkiego. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film przedstawia procedurę przygotowania ludzkiego oka do badania wpływu ciśnienia translaminarnego na sygnalizację komórek zwojowych siatkówki poprzez symulację ciśnienia wewnątrzgałkowego i wewnątrzczaszkowego w translaminarnym układzie autonomicznym.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie i sterylizacja sprzętu i materiałów eksploatacyjnych

1. Zapoznaj się z Tabelą materiałów pełną listę wymaganych materiałów eksploatacyjnych oraz numery dostawców i katalogów.
2. Przed użyciem wysterylizuj cały sprzęt i narzędzia w autoklawie lub przy użyciu ampułek z tlenku etylenu.

2. Przygotowanie pożywki perfuzyjnej

1. Dodaj 1% penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny w 0,85% NaCl) i 1% L-glutaminy (200 mM) do 1 000 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy (DMEM).
2. Wysterylizuj pożywkę perfuzyjną, przechodząc przez filtr 0,22 μm.

3. Konfiguracja translaminarnego systemu autonomicznego (TAS)

1. Konfiguracja strzykawek dopływowych (zbiorniki ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) i ciśnienia śródczaszkowego (ICP)).
   1. Dodać 30 ml pożywki perfuzyjnej (sekcja 2) do strzykawki o pojemności 30 ml. Podłączyć 3-kierunkowy kran do strzykawki o pojemności 30 ml. Podłączyć filtr hydrofilowy 0,22 μm do 3-drogowego kranu. Podłącz adapter króćca Luer 15 G do filtra hydrofilowego 0,22 μm.
   2. Usunąć pęcherzyki powietrza z zestawu strzykawki. Podłącz rurkę do adaptera króćca Luer 15 G. Zamknij boczny port kranu za pomocą niewentylowanej uniwersalnej nasadki zamka. Powtórz tę czynność dla łącznie dwóch ustawień.
   3. Oznacz jedną strzykawkę jako ciśnienie śródczaszkowe kanału 1 (CH1 ICP), a drugą strzykawkę jako ciśnienie wewnątrzgałkowe kanału 2 (CH2 IOP).
2. Ustawić strzykawki odpływowe (zbiorniki IOP i ICP).
   1. Podłączyć 3-kierunkowy kran do strzykawki o pojemności 30 ml. Podłączyć króciec Luer 15 G do 3-drogowego krana odcinającego. Podłącz rurkę do adaptera króćca Luer 15 G.
   2. Zamknij boczny port kranu za pomocą niewentylowanej uniwersalnej nasadki zamka. Powtórz tę czynność dla łącznie dwóch ustawień. Oznaczyć jedną strzykawkę jako CH1 ICP, a drugą strzykawkę jako CH2 IOP.

4. Przygotowanie gałki całego oka ludzkiego

UWAGA: Jeśli otrzymasz całe oczy, postępuj zgodnie z poniższą procedurą, aby oddzielić przedni odcinek od tylnego odcinka oka. Jeśli oczy są podzielone na pół, zacznij od kroku 4.4.

1. Umieść całe oko w roztworze jodu powidonu na 2 minut.
2. Przepłucz oko w sterylnym roztworze buforowanym fosforanem (PBS), aby usunąć jod powidonu. Powtórz dwa razy.
3. Usuń przydatki z całej gałki oka za pomocą kleszczy i nożyczek. Przetnij oko na pół na równiku, aby oddzielić przedni i tylny segment oka.
4. Usuń osłonkę nerwu wzrokowego. Usuń ciało szkliste z tylnego segmentu.
5. W razie potrzeby przyciąć dodatkową twardówkę z tylnego segmentu, aby zapewnić dobre dopasowanie do okrągłej kopuły komory IOP (dolnej). Za pomocą kleszczy upewnij się, że siatkówka jest równomiernie rozłożona na tylnej części segmentu.
6. Ustawienie komory IOP (dolnej)
   1. Umieść ludzki tylny segment w komorze IOP (dolnej) TAS nad okrągłą kopułą z nerwem wzrokowym skierowanym do góry.
   2. Uszczelnij tylny segment za pomocą O-ringu z żywicy epoksydowej z czterema śrubami, zapewniając szczelne uszczelnienie.
   3. Włóż rurkę do portów IN i OUT komory IOP (na dole). Strzykawka wlotowa IOP z rurką zawierającą medium jest wkładana do portu IN, a pusta strzykawka odpływowa IOP z rurką jest wkładana do portu OUT.
   4. Użyj metody pchania/ciągnięcia, aby powoli wlewać medium perfuzyjne do portu dopływowego, aby napełnić tylną muszlę oczną, jednocześnie powoli wyciągając medium perfuzyjne przez strzykawkę odpływową, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z przewodów. Przerwij zaparzanie pożywki, gdy zarówno rurki IN, jak i OUT są wolne od pęcherzyków powietrza.
   5. Zablokuj kurki w pozycji wyłączonej. Wyjmij strzykawkę o pojemności 30 ml z zespołu filtra portu IOP IN i napełnij ją 30 ml pożywki. Następnie wymienić strzykawkę na zespół filtra.
7. Konfiguracja komory ICP (górnej)
   1. Umieść komorę/pokrywę ICP (górną) z tyłu tylnego segmentu. Upewnij się, że nerw wzrokowy znajduje się w górnej komorze. Uszczelnij górną komorę czterema śrubami.
   2. Włóż rurkę do portów IN i OUT komory ICP (górnej). Strzykawka odpływowa ICP z rurką zawierającą medium jest wkładana do portu IN, a pusta strzykawka odpływowa ICP z rurką jest wkładana do portu OUT.
   3. Delikatnie i powoli wlej medium do portu IN, aby napełnić komorę ICP i usunąć pęcherzyki powietrza z przewodów metodą push/pull. Przestań zaparzać pożywkę, gdy komora ICP i rurki IN i OUT będą wolne od pęcherzyków powietrza.
   4. Zablokuj kurki w pozycji wyłączonej. Wyjąć strzykawkę o pojemności 30 ml z ICP w zespole filtra portu i ponownie napełnić ją 30 ml pożywki. Następnie wymienić strzykawkę na zespół filtra.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#122, 1-1/8" średnica wewnętrzna x 1-5/16" średnica zewnętrzna, O-ring z Vitonu, grubość 3/32", 755 Durometer 50 Pack		B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, twardość 70A, czarny, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" szerokość (opakowanie 100)	Amazon	B000FMYRHK
30 mL bez igły	Vitality Medical	302832
3-kierunkowy kran, 2 żeńskie zamki Luer, obrotowy męski zamek Luer, wentylowana nasadka	QOSINA	2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & śrubokręt krzyżakowy odpowiedniej wielkości	Łączniki ze stali nierdzewnej Brikksen	PPMSSSCH4C.5
ANPROLENE 16 DUŻA AMPUŁKA	Fisher Scientific	NC9085343
Betadine	Purdue	PUR1815001EACH		Hodowla tkankowa Corning 100 x 20mm kultury potraw	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA
Corning L-glutamine Solution	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gąbka z gazy, 4" x 4", 12-warstwowa, sterylna, 1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
Kleszcze opatrunkowe delikatne zakrzywione (ząbkowane)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - Cienkie kleszcze	F.S.T.	11254-20
Nożyczki do oczu standardowe zakrzywione	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15mm Zwykłe sterylne jednorazowe szalki Petriego	Capitol Scientific	351058
Fisherbrand 4 oz. Pojemniki na próbki	Fisher Scientific	16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium	Fisher Scientific	SH3024302
HyClone Penicylina Streptomycyna 100X Solution	Fisher Scientific	SV30010
Filtr hydrofilowy z żeńskim wlotem Luer Lock, męskim wylotem Luer Slip, niebieski i przezroczysty	Qosina	28217
Przetworniki ciśnienia hydrostatycznego, DELTRAN ® II, Katalog # DPT-200 z natężeniem przepływu 3CC/HR	AD instruments	DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dozownik 50/Box	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15
Mikroskop Keyence B2‐X710	Keyence	-X710
LabChart 8	AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
Niewentylowana uniwersalna nasadka Luer Lock, biała	QOSINA	65811
Octal Bridge Amp (model # FE228)	AD instruments	FE228
Produkty Pharmco ALKOHOL ETYLOWY, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398
Roztwór buforowany fosforanem (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)	AD instruments	PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36935
Złączka rurkowa Push-to-Connect do adaptera prostego powietrza i wody, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT męska	McMAster-Carr	7880T113
Złączka rurkowa Push-to-Connect z gwintem uniwersalnym do powietrza i wody, adapter, rura 1/8" OD x 1/8 rury	McMAster-Carr	51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 E-3603 Elastyczna rura 500 ft.	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
Nożyczki chirurgiczne - ostro-tępe	F.S.T.	14001-14
Kleszczyki do tkanek Delikatne zęby 1x2 zakrzywione	Katena	K5-4110
Translaminarny System Autonomiczny (TAS)	Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Północnego Teksasu	N/A
USA Rozmiar 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Czarny, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030

Amazon