Opracowanie modelu ciśnienia translaminarnego przy użyciu translaminarnego systemu autonomicznego

Abstract

Źródło: Sharma, T. P., i wsp., Translaminarny model autonomicznego systemu do modulacji ciśnienia wewnątrzgałkowego i śródczaszkowego w tylnych segmentach dawcy ludzkiego. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film przedstawia procedurę przygotowania ludzkiego oka do badania wpływu ciśnienia translaminarnego na sygnalizację komórek zwojowych siatkówki poprzez symulację ciśnienia wewnątrzgałkowego i wewnątrzczaszkowego w translaminarnym układzie autonomicznym.

Protocol

Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie i sterylizacja sprzętu i materiałów eksploatacyjnych

1. Zapoznaj się z Tabelą materiałów pełną listę wymaganych materiałów eksploatacyjnych oraz numery dostawców i katalogów.
2. Przed użyciem wysterylizuj cały sprzęt i narzędzia w autoklawie lub przy użyciu ampułek z tlenku etylenu.

2. Przygotowanie pożywki perfuzyjnej

1. Dodaj 1% penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny w 0,85% NaCl) i 1% L-glutaminy (200 mM) do 1 000 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy (DMEM).
2. Wysterylizuj pożywkę perfuzyjną, przechodząc przez filtr 0,22 μm.

3. Konfiguracja translaminarnego systemu autonomicznego (TAS)

1. Konfiguracja strzykawek dopływowych (zbiorniki ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) i ciśnienia śródczaszkowego (ICP)).
   1. Dodać 30 ml pożywki perfuzyjnej (sekcja 2) do strzykawki o pojemności 30 ml. Podłączyć 3-kierunkowy kran do strzykawki o pojemności 30 ml. Podłączyć filtr hydrofilowy 0,22 μm do 3-drogowego kranu. Podłącz adapter króćca Luer 15 G do filtra hydrofilowego 0,22 μm.
   2. Usunąć pęcherzyki powietrza z zestawu strzykawki. Podłącz rurkę do adaptera króćca Luer 15 G. Zamknij boczny port kranu za pomocą niewentylowanej uniwersalnej nasadki zamka. Powtórz tę czynność dla łącznie dwóch ustawień.
   3. Oznacz jedną strzykawkę jako ciśnienie śródczaszkowe kanału 1 (CH1 ICP), a drugą strzykawkę jako ciśnienie wewnątrzgałkowe kanału 2 (CH2 IOP).
2. Ustawić strzykawki odpływowe (zbiorniki IOP i ICP).
   1. Podłączyć 3-kierunkowy kran do strzykawki o pojemności 30 ml. Podłączyć króciec Luer 15 G do 3-drogowego krana odcinającego. Podłącz rurkę do adaptera króćca Luer 15 G.
   2. Zamknij boczny port kranu za pomocą niewentylowanej uniwersalnej nasadki zamka. Powtórz tę czynność dla łącznie dwóch ustawień. Oznaczyć jedną strzykawkę jako CH1 ICP, a drugą strzykawkę jako CH2 IOP.

4. Przygotowanie gałki całego oka ludzkiego

UWAGA: Jeśli otrzymasz całe oczy, postępuj zgodnie z poniższą procedurą, aby oddzielić przedni odcinek od tylnego odcinka oka. Jeśli oczy są podzielone na pół, zacznij od kroku 4.4.

1. Umieść całe oko w roztworze jodu powidonu na 2 minut.
2. Przepłucz oko w sterylnym roztworze buforowanym fosforanem (PBS), aby usunąć jod powidonu. Powtórz dwa razy.
3. Usuń przydatki z całej gałki oka za pomocą kleszczy i nożyczek. Przetnij oko na pół na równiku, aby oddzielić przedni i tylny segment oka.
4. Usuń osłonkę nerwu wzrokowego. Usuń ciało szkliste z tylnego segmentu.
5. W razie potrzeby przyciąć dodatkową twardówkę z tylnego segmentu, aby zapewnić dobre dopasowanie do okrągłej kopuły komory IOP (dolnej). Za pomocą kleszczy upewnij się, że siatkówka jest równomiernie rozłożona na tylnej części segmentu.
6. Ustawienie komory IOP (dolnej)
   1. Umieść ludzki tylny segment w komorze IOP (dolnej) TAS nad okrągłą kopułą z nerwem wzrokowym skierowanym do góry.
   2. Uszczelnij tylny segment za pomocą O-ringu z żywicy epoksydowej z czterema śrubami, zapewniając szczelne uszczelnienie.
   3. Włóż rurkę do portów IN i OUT komory IOP (na dole). Strzykawka wlotowa IOP z rurką zawierającą medium jest wkładana do portu IN, a pusta strzykawka odpływowa IOP z rurką jest wkładana do portu OUT.
   4. Użyj metody pchania/ciągnięcia, aby powoli wlewać medium perfuzyjne do portu dopływowego, aby napełnić tylną muszlę oczną, jednocześnie powoli wyciągając medium perfuzyjne przez strzykawkę odpływową, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z przewodów. Przerwij zaparzanie pożywki, gdy zarówno rurki IN, jak i OUT są wolne od pęcherzyków powietrza.
   5. Zablokuj kurki w pozycji wyłączonej. Wyjmij strzykawkę o pojemności 30 ml z zespołu filtra portu IOP IN i napełnij ją 30 ml pożywki. Następnie wymienić strzykawkę na zespół filtra.
7. Konfiguracja komory ICP (górnej)
   1. Umieść komorę/pokrywę ICP (górną) z tyłu tylnego segmentu. Upewnij się, że nerw wzrokowy znajduje się w górnej komorze. Uszczelnij górną komorę czterema śrubami.
   2. Włóż rurkę do portów IN i OUT komory ICP (górnej). Strzykawka odpływowa ICP z rurką zawierającą medium jest wkładana do portu IN, a pusta strzykawka odpływowa ICP z rurką jest wkładana do portu OUT.
   3. Delikatnie i powoli wlej medium do portu IN, aby napełnić komorę ICP i usunąć pęcherzyki powietrza z przewodów metodą push/pull. Przestań zaparzać pożywkę, gdy komora ICP i rurki IN i OUT będą wolne od pęcherzyków powietrza.
   4. Zablokuj kurki w pozycji wyłączonej. Wyjąć strzykawkę o pojemności 30 ml z ICP w zespole filtra portu i ponownie napełnić ją 30 ml pożywki. Następnie wymienić strzykawkę na zespół filtra.

Materials