Test fagocytozy żywych komórek komórek podobnych do mikrogleju przy użyciu ludzkich synaptosomów

Streszczenie

Źródło: Funes, S., et. al., Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia test do badania zdolności fagocytarnej komórek podobnych do mikrogleju przy użyciu wrażliwych na pH synaptosomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym.

Protokół

1. Test fagocytozy żywej komórki
   1. Płytka 20-30 × 10⁴ PMP na 96-dołkowe płytki w 100 μL iMG complete medium i postępuj zgodnie z procesem różnicowania przez 10 dni.
   2. W dniu testu należy przygotować roztwór do barwienia jądrowego, dodając 1 kroplę barwnika jądrowego dla żywych komórek do 2 ml iMG podłoża podstawowego.
   3. Usunąć 40 μl pożywki z każdego dołka z płytki 96-dołkowej i dodać 10 μl roztworu do barwienia jądrowego za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 2 godziny.
   4. Rozmrozić znakowane synaptosomy na lodzie i delikatnie sonikować za pomocą sonikatora wodnego przez 1 minutę. Natychmiast przenieś synaptosomy z powrotem do lodu. Rozcieńczyć znakowane synaptosomy w iMG kompletnej pożywce w stosunku 1 μl synaptosomów na 50 μl pożywki.
      UWAGA: Stężenie synaptosomu jest zależne od testu i może wymagać optymalizacji. Aby utrzymać stosunkowo niski procent (tj. 0,1% lub mniej) DMSO w pożywce, zaleca się, aby nie dodawać więcej niż 2 μl synaptosomów na studzienkę.
   5. Jako kontrolę negatywną należy wstępnie potraktować niektóre studzienki cytochalazyną D, aby zahamować polimeryzację aktyny, a tym samym fagocytozę. Przygotować roztwór 60 μM cytochalazyny D w iMG complete medium. Dodać 10 μl tego roztworu do każdej studzienki dla końcowego stężenia 10 μM i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 30 minut.
   6. Wyjąć płytkę z inkubatora i inkubować w temperaturze 10 °C przez 10 minut. Utrzymuj płytkę na lodzie i dodaj 50 μl pożywki zawierającej synaptosomy.
   7. Odwirować płytkę w temperaturze 270 × g przez 3 minuty w temperaturze 10 °C i utrzymywać płytkę na lodzie do momentu uzyskania obrazowania.
2. Akwizycja i analiza obrazowania
   1. Włóż płytkę do czytnika obrazowania żywych komórek i wybierz studzienki do analizy.
   2. Wybierz obiektyw 20x .
   3. Dostosuj focus, diodę elektroluminescencyjną (LED), intensywność , czas integracji i gain kanałów brightfield i blue (4',6-diamidino-2-fenyloindol [DAPI]). Fluorescencja synaptosomów powinna być znikoma w początkowym punkcie czasowym. Użyj kanału brightfield jako odniesienia, aby skupić się na kanale red (RFP). Czas integracji i wzmocnienie mogą się różnić w zależności od eksperymentu; użyj tych początkowych ustawień dla kanału czerwonego: LED: 4, czas integracji: 250 i gain: 5.
   4. Wybierz liczbę pojedynczych płytek, które mają zostać pozyskane w montażu na odwiert (na przykład, zdobądź 16 płytek w środku studni, obrazując w ten sposób około 5% całkowitej powierzchni studni). Ustaw temperatura, na 37 °C i żądany przedział czasu dla obrazowania.
      UWAGA: Obrazy były pozyskiwane co 1 - 2 godziny przez okres do 16 godzin w tym badaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały do hodowli komórkowych
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning	353872
CellAdhere Laminin-521	STEMCELL Technologia	77004	Odnosi się do lamininy 521
Składniki nośnika bazowego iMG
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	Końcowe stężenie 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Końcowe stężenie 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	Końcowe stężenie 1x
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Gibco	15140122	Końcowe stężenie 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-merkaptoetanol	Gibco	21985023	Stężenie końcowe 55 μM
IL-34	PeproTech or Biologend	200-34 or 577904	Końcowe stężenie 100 ng/mL
iMG base media			Końcowe stężenie 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	Końcowe stężenie 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	Końcowe stężenie 50 ng/mL
Barwniki do oznaczania fagocytozy
odczynnik NucBlue Live Ready	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester	ThermoFisher Scientific	P36600	Odnosi się do barwnika
Inne odczynniki do hodowli komórkowych
Cytochalasin D	Sigma		Końcowe stężenie 10 μM
Software and Equipment
Centrifuge<	Model 5810R	<
Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software<	version 3.03

wrażliwego na pHtd style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Eppendorftd style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Cytation 5 czytnik obrazowania żywych komórektd style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Biotek