$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Kwantyfikacja komórek zwojowych siatkówki soma
UWAGA: Poniższa procedura służy do oznaczania ilościowego somy RGC, w oparciu o immunohistochemiczne barwienie płaskich mocowań siatkówki przeciwciałem przeciwko specyficznemu dla mózgu białku domeny homeobox/POU 3A (Brn3a).
- Przenieś izolowane siatkówki na 24-dołkową płytkę hodowlaną (jedna siatkówka na dołek) zawierającą 1 ml 1x PBS i trzymaj wewnętrzną siatkówkę skierowaną do góry.
- Przepuszczalność tkanek poprzez przemycie 3x przez 10 min niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym 0,5% rozcieńczonym w 1x PBS (0,3 ml). Następnie delikatnie wstrząsaj tkanką w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w niejonowym środku powierzchniowo czynnym 2% i 1x PBS (roztwór blokujący; 0,25 ml) przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
- W kroku 1.2 przygotuj roztwór przeciwciała pierwszorzędowego Brn3a, rozcieńczając 1:200 w niejonowym 0,5% środku powierzchniowo czynnym i 1x PBS plus 5% BSA, a następnie przechowuj go w temperaturze 4 °C.
- Po 60 minutach blokowania tkanek inkubować siatkówki w 0,2 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze 4 °C przez 72 godziny, delikatnie wstrząsając.
- Myć tkankę 3x przez 10 min z 1x PBS, następnie inkubować tkankę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w 0,2 ml roztworu przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego 1:750 w 1x PBS plus 5% BSA.
- Następnie inkubować tkankę przez 10 minut w roztworze przeciwbarwnika jądrowego do barwienia jąder fluorescencyjnych. Zakończ immunohistochemię końcowym etapem płukania z 1x PBS (0,3 ml) powtórzonym 3x.
- Przenieś siatkówki za pomocą dwóch małych szczoteczek na szklane szkiełka mikroskopowe, utrzymując stronę szklistą do góry. Ustaw kwadrant grzbietowej siatkówki do góry na szkiełkach mikroskopowych. Wykonaj jeszcze dwa promieniste cięcia w kierunku głowy nerwu wzrokowego, aby wyznaczyć pozostałe 3 ćwiartki (nosową, brzuszną i skroniową).
UWAGA: Wymiary cięcia nie są stałe. Nie powinny być zbyt krótkie, aby upośledzać skuteczne spłaszczenie siatkówki na szkiełku i nie powinny być zbyt długie, aby docierały do otworu nerwu wzrokowego i całkowicie oddzielały wyznaczony kwadrant siatkówki od reszty tkanki. - Na koniec nałóż 0,2 ml podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu na szklane szkiełko nakrywkowe i umieść je na płasko zamontowanej siatkówce w celu analizy mikroskopowej tkanek. Aby oszacować gęstość RGC, zbadaj płaskie mocowania pod konfokalnym mikroskopem epifluorescencyjnym przy użyciu obiektywu 40x/1,3.
- Dla każdej ćwiartki siatkówki wykonaj osiem zdjęć: dwa z centralnej siatkówki (~0,9 mm od tarczy nerwu wzrokowego), trzy ze środkowej siatkówki (~2,0 mm od tarczy nerwu wzrokowego) i trzy z siatkówki obwodowej (~3,7 mm od tarczy nerwu wzrokowego), co daje w sumie 32 zdjęcia na siatkówkę. Użyj oprogramowania FIJI, aby policzyć komórki Brn3a-dodatnie i oszacować średnią gęstość komórek.