Analiza dynamiki wapnia i zmian potencjału błonowego w śródbłonku tętniczym myszy

Streszczenie

Źródło: Hakim, M. A. i inni., Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film przedstawia analizę funkcjonalną śródbłonka tętniczki wyizolowanej z mózgu myszy. Przedstawiono w nim etapy pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i potencjału błonowego, zarówno na początku badania, jak i w odpowiedzi na stymulację farmakologiczną.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Materiały i sprzęt

UWAGA: Zobacz Tabeli materiałów w celu uzyskania informacji o wszystkich odczynnikach i materiałach wymaganych do tego protokołu. Ponadto w razie potrzeby można również zapoznać się z instrukcjami i stronami internetowymi powiązanymi z odpowiednimi dostawcami.

1. Komora przepływowa
   1. Przymocuj komorę superfuzyjną ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym do platformy wykonanej z anodyzowanego aluminium. Przymocuj platformę z komorą do aluminiowego stolika mikroskopu.
   2. Ustaw mikromanipulator z pipetą przypinającą na każdym końcu platformy na aluminiowym stoliku mikroskopu.
      UWAGA: Jeśli to konieczne, użyj przenośnego aparatu scenicznego z jednostką komory przepływowej, aby przenieść zabezpieczoną, izolowaną rurkę śródbłonka z jednego aparatu mikroskopowego do drugiego w celu eksperymentowania.
2. Mikroskopy
   1. Ustaw aparaturę doświadczalną, ustawiając mikroskop odwrócony (obiektywy: 4x, 10x, 20x, 40x i 60x) oraz ręczny aluminiowy stolik na stole wibroizolacyjnym.
3. Wewnątrzkomórkowy V_m sprzęt rejestrujący
   1. Podłącz elektrometr do kompatybilnej stacji czołowej. Używaj akcesoriów, takich jak generator funkcyjny i stymulator, w przypadku protokołów wymagających wstrzyknięcia prądu.
   2. Podłącz wyjścia wzmacniacza do systemu digitalizatora danych, oscyloskopu i dźwiękowych monitorów linii bazowej. Zamocuj elektrodę do kąpieli referencyjnej (granulat Ag/AgCl) w pobliżu wyjścia z komory przepływowej.
   3. Zmontuj system fotometryczny ze zintegrowanymi komponentami, takimi jak interfejs systemu fluorescencji, lampa łukowa o dużej intensywności i zasilacz, hiperswitch, lampa fotopowielacza (lub PMT) i kamera do pomiaru [Ca²⁺]_i w komórkach śródbłonka.
   4. Zamontuj regulator temperatury wyposażony w grzałkę liniową, aby podnieść i utrzymać temperaturę fizjologiczną (37 °C) przez cały czas trwania eksperymentu.
   5. Zamontuj platformę wielokanałową połączoną ze sterownikiem zaworu z wbudowanym zaworem sterującym przepływem, aby kontrolować dostarczanie roztworów do rurek śródbłonka zabezpieczonych w komorze.
4. Mikropipety i ostre elektrody
   UWAGA: Eksperymentator będzie potrzebował elektronicznego ściągacza do szkła oraz mikrokuźni do przygotowania pipet do przypinania.
   1. Aby zabezpieczyć rurkę śródbłonka w komorze superfuzyjnej, należy przygotować polerowane na gorąco pipety pinowe z tępym, kulistym końcem (średnica zewnętrzna: 50-70 μm) przygotowane z cienkościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego.
   2. Aby zarejestrować V_m komórki śródbłonka, przygotuj ostre elektrody o rezystancji końcówki ~150 ± 30 MΩ ze szklanych naczyń włosowatych za pomocą samego ściągacza do szkła.

2. Roztwory i leki

1. Fizjologiczny roztwór soli (PSS)
   1. Przygotuj minimum 1 l PSS za pomocą 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hydroksyetylopiperazyna-N'{{}}-kwas 2-etanosulfonowy (HEPES) i 10 mM glukozy.
   2. Przygotuj niezbędne roztwory brakujące CaCl₂ (zero Ca²⁺ PSS) do wypreparowania tętniczek mózgowych i izolacji jajowodów śródbłonka.
      UWAGA: Przygotuj wszystkie roztwory w ultraczystym dejonizowanym H₂O, a następnie przefiltruj (0,22 μm). Upewnij się, że produkt końcowy ma pH 7,4 i osmolalność między 290 a 300 mOsm.
2. Fura-2 i środki farmakologiczne
   1. Przygotuj zapas Fura-2 AM w dimetylosulfotlenku (DMSO; 1 mM). Przygotować 500 μl stężenia roboczego (10 μM), dodając 5 μl wywaru do 495 μl PSS do załadunku.
   2. Przygotować co najmniej 50 ml roboczych stężeń środków farmakologicznych w PSS lub DMSO, odpowiednio.
3. Roztwór dyrygujący
   1. Przygotuj 2 M KCl, rozpuszczając KCl w dejonizowanym H₂O (7,455 g KCl w 50 ml H₂O). Przepuść roztwór przez strzykawkę z filtrem 0,22 μm przed zasypaniem ostrych elektrod.

3. Wykorzystanie śródbłonka tętniczek do badania fizjologii komórkowej{{}}

UWAGA: Izolowane i zabezpieczone śródbłonki tętniczek mogą być używane do wewnątrzkomórkowych zapisów [Ca^2+{]_idynamika i V_m przy użyciu odpowiednio fotometrii i elektrofizjologii elektrod ostrych, jak wcześniej zilustrowano (Rysunek 1). [Ca²⁺]_i i V_m mogą być mierzone jako oddzielne lub połączone zmienne eksperymentalne (Rysunek 1). Jednak śródbłonek tętniczek jest delikatniejszy niż śródbłonek tętniczy, a czas eksperymentowania nie powinien przekraczać 1 godziny.

1. Pomiar [Ca²⁺]_i
   1. Włącz sprzęt i oprogramowanie dla nagrań [Ca²⁺]_i{ przy zachowaniu ciągłej superfuzji przy natężeniu przepływu 5-7 ml/min.
   2. Załaduj rurkę śródbłonka za pomocą Ca²⁺ barwnik Fura-2 AM przez 30 min w temperaturze pokojowej. Przemywać komórki roztworem superfuzyjnym przez kolejne 20-30 minut, stopniowo podnosząc temperaturę kąpieli do 37 °C. Utrzymuj temperaturę 37 °C przez cały czas trwania eksperymentu.
   3. Ręcznie dostosuj okno obrazowania za pomocą oprogramowania fotometrycznego, aby ustawić ostrość na ~20 komórkach śródbłonka (Rysunek 1A). W przypadku braku światła włącz PMT na interfejsie fluorescencji i rozpocznij akwizycję [Ca²⁺]_i poprzez wzbudzanie Fura-2 na przemian (≥10 Hz) przy 340 nm i 380 nm, zbierając emisję fluorescencji przy 510 nm. Po ustaleniu stabilnego zapisu bazowego [Ca²⁺]_i, zastosuj środki farmakologiczne (np. agonistów receptora purynergicznego) zgodnie z celem eksperymentalnym (Rysunek 1B).
2. Pomiar V_m
   1. Włącz sprzęt i oprogramowanie dla nagrań V_m i ustaw szybkość akwizycji danych (≥10 Hz) przy zachowaniu ciągłego superfuzji przy natężeniu przepływu 5-7 ml/min. Stopniowo podnosić temperaturę kąpieli do 37 °C i utrzymywać ją do końca doświadczenia.
   2. Wyciągnąć ostrą elektrodę za pomocą kapilary ze szkła borokrzemianowego, zasypać 2 M KCl i zabezpieczyć ją na srebrnym drucie pokrytym chlorkiem w uchwycie na pipetę przymocowanym do elektrometru, który z kolei jest trzymany przez mikromanipulator.
   3. Podczas patrzenia przez obiektyw 4x użyj mikromanipulatora, aby ostrożnie ustawić ostrą końcówkę elektrody tuż nad komórką śródbłonka tętniczki do przepływającego PSS w komorze.
   4. Stopniowo zwiększaj powiększenie do 400x i w razie potrzeby zmień położenie końcówki elektrody.
   5. Za pomocą mikromanipulatora delikatnie włóż końcówkę ostrej elektrody do jednej z komórek rurki śródbłonka i rozpocznij rejestrację V_m} za pomocą elektrometru (Rysunek 1A).

Gdy spoczynek śródbłonka V_m jest stabilny (−30 do −40 mV), zastosuj pożądane środki farmakologiczne zgodnie z celem eksperymentalnym (Rysunek 1C).

Wyniki

Rycina 1: Zastosowanie rurki śródbłonka do fizjologicznego badania szlaków związanych z regulacją przepływu krwi. (A) Ostra elektroda (fioletowa strzałka) jest umieszczona w komórce rurki śródbłonka zogniskowanej w oknie akwizycji danych do fotometrii. (B) Reprezentatywny zapis wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ przy użyciu fotometrii Fura-2 w odpowiedzi na MTA (1 μM)...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wzmacniacze	Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Monitory dźwiękowe	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Chłodziarka do kąpieli (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
BSA: Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A7906
CaCl2: Chlorek wapnia	Sigma	223506
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Zawór sterujący przepływem	Warner Instruments	FR-50
Interfejs systemu fluorescencji, lampa ARC i zasilacz, hyperswitch i PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Function Generator	EZ Digital, Seoul, Korea Południowa	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Kwas solny	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy)Sigma		H4034
Wbudowany podgrzewacz roztworu	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Chlorek potasu	Sigma	P9541
MgCl2: Chlorek magnezu	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, Nowy Jork, USA	MF-900
Mikromanipulator	Siskiyou	MX10
Ściągacz do mikropipet (cyfrowy)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 lub P-1000
Mikroskop (odwrócony Nikon)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Mikroskop ( Nikon	Instruments Inc	Eclipse TS100
Obiektywy mikroskopowe	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) i 40X (Plan Fluor)
Platforma mikroskopu (anodowane aluminium; średnica, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 lub PH6
Stolik mikroskopowy (aluminium)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
MTA: sól trisodowa 2-metylotioadenozynodifosforanu	Tocris	1624
NaCl: Chlorek sodu	Sigma	S7653
NaOH: Wodorotlenek sodu	Sigma	S8045
Oscyloskop	Tektronix, Beaverton, Oregon, Stany Zjednoczone	TDS 2024B
Obiektywy kontrastu fazowego	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X i 20X)
Komora superfuzyjna z pleksiglasu	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Mikroskopy stereoskopowe	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Filtr strzykawkowy (0.22 μm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Regulator temperatury (dwukanałowy)	Warner Instruments	TC-344B lub C
System sterowania zaworem	Warner Instruments	VC-6
Stół do izolacji drgań	Produkcja techniczna, Peabody, MA, USA	Micro-g