Ocena poziomu neuroprzekaźników pobudzających u szczurów z przewlekłą padaczką

Streszczenie

Źródło: Soukupová, M., et al. Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film przedstawia ocenę poziomu zewnątrzkomórkowego neuroprzekaźnika pobudzającego u szczurów z przewlekłą indukcją padaczki. Po wszczepieniu sondy do mikrodializy do mózgu i potwierdzeniu braku napadów za pomocą elektroencefalografii (EEG), pobiera się płyn zewnątrzkomórkowy w celu oceny podwyższonego poziomu neuroprzekaźników u szczurów z padaczką. Następnie podaje się roztwór o wysokiej zawartości potasu, aby podtrzymać pobudliwość neuronów i wywołać zwiększone uwalnianie neuroprzekaźników, z próbkami pobranymi w celu oceny wywołanego potasem piku neuroprzekaźników pobudzających.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

Ten protokół jest specjalnie dostosowany do oznaczania glutaminianu i asparaginianu w dializatach mózgu szczurów uzyskanych pod kontrolą EEG sesji mikrodializy u szczurów padaczkowych i niepadaczkowych. Wiele z opisanych tu materiałów można łatwo zastąpić tymi, które wykorzystuje się w swoim laboratorium do zapisów EEG czy mikrodializy.

1. Montaż sondy mikrodializy-elektrody

1. Użyj 3-kanałowej dwukanałowej elektrody skręconej (z co najmniej 20 mm długością cięcia elektrody rejestrującej i elektrodą uziemiającą o długości 10 cm) i połącz ją z kaniulą prowadzącą, aby przygotować urządzenie. Zobacz przykłady 3-kanałowej elektrody i kaniuli prowadzącej do dializy na Rysunek 1A-1B.
2. Wyjmij (Rysunek 1C) i włóż (Rysunek 1D) metalową kaniulę prowadzącą do atrapy plastikowej kaniuli kilka razy przed użyciem, aby ułatwić jej wyjęcie w momencie przełączania na sondę do mikrodializy u zwierząt.
3. Zegnij skręcone druty elektrody rejestrującej dwa razy (Rysunek 1E-1F), aby wyrównać przewody z atrapą kaniuli prowadnicy i przyciąć końcówkę elektrody (Rysunek 1G) tak, aby była o 0,5 mm dłuższa niż końcówka kaniuli prowadzącej (Rysunek 1H) za pomocą suwmiarki cyfrowej.
4. Przygotuj silikonowy krążek o długości 1 mm (średnica zewnętrzna 2 mm, grubość 0,3 mm; Rysunek 1I) i włóż końcówkę kaniuli prowadzącej oraz końcówkę skręconych elektrod do silikonowego krążka za pomocą pęsety (Rysunek 1J). Przymocuj go do podstawy cokołu kaniuli prowadzącej za pomocą kleju polimerowego o szybkim działaniu lub żywicy (Rysunek 1K). Zobacz przykład ukończonych urządzeń na Rysunek 1L i Rysunek 2A.
5. Sterylizuj urządzenie w bakteriobójczym świetle UV przez 4 godziny. Obróć urządzenie cztery razy, tak aby każda z jego stron była wystawiona na działanie światła przez 1 godzinę.
   Uwaga: Wiele domowych elektrod i sond do mikrodializy można zmontować w podobny sposób. Głowa wyżej opisanego implantu dla szczurów ma następujące wymiary: 7 mm szerokości x 5 mm głębokości x 10 mm długości od czubka do palca cokołu; Końcówka implantu ma około 11 mm długości, średnicę 600 μm, a całe urządzenie waży około 330-360 mg. Wyrób może być ponownie użyty dwa lub trzy razy, jeżeli (i) wystarczająca długość elektrody uziemiającej zostanie pozostawiona na czaszce podczas operacji do następnego użycia oraz (ii) gdy zwierzę zostanie uśmiercone, a wyrób odzyskany wraz z cementem dentystycznym pozostawia się go na noc w acetonie, tak aby cement mógł zostać mechanicznie zdezagregowany, a urządzenie ponownie umyte i wysterylizowane.

2. Chirurgia stereotaktyczna

1. Użyj aparatu stereotaktycznego i uchwytu na klips do sondy (Rysunek 2B) do implantacji urządzenia zgodnie ze współczesnymi standardami dla operacji aseptycznych i bezbolesnych.
   1. Znieczulić dorosłe szczury Sprague-Dawley mieszaniną ketaminy/ksylazyny (43 mg/kg i 7 mg/kg, i.p.) i przymocować ją do ramki stereotaktycznej. Dodać znieczulenie izofluranem (1,4% w powietrzu; 1,2 ml/min) do początkowego wstrzyknięcia ketaminy/ksylazyny, ponieważ pozwala to kontrolować głębokość znieczulenia w czasie. Ogol futro na głowie zwierzęcia.
2. Przetrzyj powierzchnię skóry głowy roztworem na bazie jodu, a następnie 70% etanolem, aby przygotować ją do operacji aseptycznej.
   1. Wszczepić przygotowaną w pierwszej kolejności kaniulę prowadzącą (1,1 – 1,5) do prawego brzusznego hipokampa, podając następujące współrzędne: belka nosowa + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm do bregmy. Postępuj zgodnie ze standardowymi technikami operacji stereotaktycznych.
   2. Upewnij się, że nie zakrywa śrub kotwiących. Montując go na aparacie stereotaktycznym, chwyć urządzenie za głowicę kaniuli prowadzącej, ponieważ można ją łatwo dopasować do uchwytu sondy.
3. Zakotwicz urządzenie w czaszce za pomocą co najmniej czterech śrub ze stali nierdzewnej, wkręcając je w kość czaszki (1 śruba w lewą i 1 śruba w prawą przednią płytkę kostną, 1 śruba w lewą płytkę ciemieniową i 1 śruba w płytki kości międzyciemieniowej). Dodaj kroplę kleju tkankowego, aby dodatkowo przymocować każdą śrubę do kości czaszki.
   1. Przykryj połowę gwintów śrub cementem metakrylowym. Promuj wiązanie cementu, wykonując płytkie rowki w kości, aby zwiększyć przyczepność.
4. Gdy końcówka urządzenia zostanie umieszczona w tkance mózgowej, skręć drut elektrody uziemiającej wokół 3 śrub kotwiących. Przykryj wszystkie zamontowane śruby i urządzenie cementem dentystycznym.
5. Monitoruj zwierzęta podczas zabiegu i przez około 1 godzinę po jego zakończeniu, aż osiągną pozycję pionową i będą poruszać się po klatce. Trzymaj je na podkładce rozgrzewającej, aby uniknąć hipotermii. Pozwól szczurom dojść do siebie przez co najmniej 7 dni po implantacji urządzenia.
6. Monitoruj zwierzęta co najmniej raz dziennie przez 3 dni po operacji pod kątem oznak bólu lub niepokoju. Podawać zwierzętom krem z antybiotykiem (gentamycyna 0,1%) w pobliżu miejsca nacięcia, aby zapobiec zakażeniu, oraz lek przeciwbólowy (tramadol 5 mg/kg, dootrzewnowo [i.p.]) przez 3 dni, aby zapobiec bólowi pooperacyjnemu.

3. Indukcja padaczki skroniowej przez pilokarpinę i przypisanie zwierząt do grup doświadczalnych

1. Po tygodniu rekonwalescencji pooperacyjnej przydziel zwierzęta losowo do grup: (i) zwierzęta kontrolne otrzymujące nośnik i (ii) zwierzęta padaczkowe, które otrzymają pilokarpinę. W grupie chorych na padaczkę należy stosować proporcjonalnie większą liczbę zwierząt, ponieważ nie u wszystkich szczurów, którym podawano pilokarpinę, choroba zachoruje.
2. Wstrzyknąć dawkę metyloskopolaminy (1 mg/kg mc., podskórnie [podskórnie]), a 30 minut po niej pojedyncze wstrzyknięcie pilokarpiny (350 mg/kg mc., i.p.) w celu wywołania stanu padaczkowego (SE). Wstrzyknąć metyloskopolaminę i nośnik (sól fizjologiczną) szczurom kontrolnym. Do wszystkich podań dożylnych należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 25G.
   1. Sprawdź wzrokowo, czy zwierzęta zaczynają mieć napady behawioralne (poruszanie wibrysami w ciągu 5 minut, kiwanie głową, klonowanie kończyn) i w ciągu 25 minut, ciągłe klonowanie całego ciała (SE).
3. Zatrzymaj SE 2 godziny po wystąpieniu, aby mieć śmiertelność około 25% i średni okres utajenia wynoszący około 10 dni po podaniu diazepamu (20 mg/kg, i.p.). Należy obserwować i rejestrować wszelkie napady drgawkowe, które rozpoczynają się bezpośrednio po wstrzyknięciu pilokarpiny i kontynuują przez co najmniej 6 godzin po wstrzyknięciu.
4. Podawać zwierzętom sól fizjologiczną (1 ml, i.p.) za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 25G i roztworem sacharozy (1 ml, per os [p.o.]) za pomocą strzykawki 1 ml i elastycznej igły 17G przez 2-3 dni po SE, aby przyspieszyć powrót do utraty masy ciała.
   1. Z badania należy wykluczyć zwierzęta, które nie osiągnęły początkowej masy ciała w ciągu pierwszego tygodnia po zastosowaniu pilokarpiny SE (z wyjątkiem grupy z ostrą postacią uśmierconą 24 godziny po SE, w której obserwacja masy ciała nie jest możliwa).
5. Losowo przypisz zwierzęta po SE do różnych grup eksperymentalnych (Rysunek 3): faza ostra (gdzie mikrodializa ma miejsce 24 godziny po SE), latencja (7-9 dni po SE), pierwszy spontaniczny napad (około 11 dni po SE) i okres przewlekły (rozpoczyna się około 22-24 dni po SE, tj. około 10 dni po pierwszym napadzie). Monitorować zwierzęta pod kątem występowania napadów samoistnych.
   UWAGA: Użyj następujących kryteriów włączenia/wykluczenia do dalszych eksperymentów na szczurach z padaczką: rozwój konwulsyjnego SE w ciągu 1 godziny po podaniu pilokarpiny; przyrost masy ciała w pierwszym tygodniu po SE i prawidłowe ustawienie sondy i elektrody do mikrodializy.

4. Monitorowanie i analiza zachowań epileptycznych

1. Długoterminowe monitorowanie zachowań padaczkowych
   1. Po około 6 godzinach od podania pilokarpiny (i., po zakończeniu bezpośredniej obserwacji przez badaczy), umieść zwierzęta w czystych klatkach domowych i rozpocznij 24-godzinny monitoring wideo.
   2. Kontynuuj 24-godzinny monitoring wizyjny do 5 dnia, korzystając z cyfrowego systemu nadzoru wizyjnego.
   3. Począwszy od 5 dnia, podłącz szczury w ich domowych prostokątnych klatkach do systemu rejestracji EEG na uwięzi i kontynuuj 24-godzinny monitoring wideo.
   4. Ustaw parametry na wzmacniaczu umieszczonym na zewnątrz klatki Faradaya (ustaw współczynnik wzmocnienia na każdym kanale zgodnie ze specyfiką sygnału EEG każdego zwierzęcia) i rozpocznij akwizycję EEG obserwując sygnał EEG wytwarzany przez niepodłączone kable. Użyj częstotliwości próbkowania 200 Hz i filtra dolnoprzepustowego ustawionego na 0,5 Hz.
   5. Podłącz zwierzę do kabli trzymających głowę zwierzęcia między dwoma rozciągniętymi palcami jednej ręki i przykręć złącza do cokołu elektrody drugą wolną ręką. Rozpocznij nabywanie.
      UWAGA: Upewnij się, że sygnał jest wolny od artefaktów. Typowymi artefaktami są kolce znacznie przekraczające skalę.
   6. Dzień przed eksperymentem mikrodializy przenieś zwierzęta do systemu EEG na uwięzi wyposażonego w cylindry z pleksiglasu do mikrodializy. Odłącz zwierzęta od systemu uwięzi EEG w domowej klatce, przykręcając łączniki od elektrody bez krępowania zwierzęcia. Umieść zwierzę w wysokich cylindrach z pleksi.
2. Monitorowanie zachowania epilepsji na dzień przed i w trakcie sesji mikrodializy
   1. Włącz wzmacniacz umieszczony na zewnątrz klatki Faradaya. Otwórz oprogramowanie EEG. Akwizycję EEG rozpocznij od obserwacji sygnału EEG wytwarzanego przez niepodłączone kable.
   2. Podłącz zwierzę do systemu rejestracji EEG na uwięzi, trzymając głowę zwierzęcia między dwoma rozciągniętymi palcami jednej ręki i przykręcając łączniki do cokołu elektrody drugą wolną ręką. Ustaw współczynnik wzmocnienia (wzmocnienie) na każdym kanale wzmacniacza zgodnie z sygnałem elektrody pojedynczego zwierzęcia, tak aby sygnał EEG był w skali. Pozwól zwierzęciu eksplorować nową klatkę (cylinder) przez co najmniej 1 godzinę pod bezpośrednią obserwacją badacza.
   3. UWAGA: 24 godziny przed eksperymentem mikrodializy, szczury są krótko znieczulane izofluranem w celu zamiany kaniul prowadzących na sondę do mikrodializy. Wykorzystaj moment, w którym są znieczulane, aby podłączyć je do systemu rejestracji EEG.
   4. Skróć lub przedłuż zwisający kabel w zależności od towaru zwierzęcia. Upewnij się, że kable nie przeszkadzają w ruchach zwierzęcia i pozycji leżącej.
   5. Sprawdź, czy kamery wideo są prawidłowo kadrowane w celu uzyskania efektu kadrowania. Rozpocznij zapis wideo-EEG.
3. Identyfikacja napadów i aktywności EEG
   1. Użyj odtwarzacza oprogramowania, aby oglądać filmy. Przewiń film 8 razy szybciej niż podczas odtwarzania w czasie rzeczywistym i zindywidualizuj uogólnione napady (patrz zwierzę do tyłu z klonusem kończyn przednich lub zwierzę podnoszeniem i upadkiem z klonusem kończyn przednich). Zwolnij film i zanotuj dokładny czas rozpoczęcia i zakończenia napadu behawioralnego.
   2. Przetwarzaj dane, zliczając liczbę uogólnionych napadów zaobserwowanych w ciągu 24 godzin nagrań wideo i wyraź je pod względem częstotliwości i czasu trwania napadów jako średnie wartości wszystkich napadów zaobserwowanych w ciągu 24 godzin.
   3. Zdefiniuj napady EEG jako okresy napadowej aktywności o wysokiej częstotliwości (>5 Hz) charakteryzujące się >3-krotnym przyrostem amplitudy w stosunku do wartości wyjściowej z progresją częstotliwości skoku, która trwa przez co najmniej 3 s lub podobnie. Użyj oprogramowania EEG do przetworzenia surowych zapisów EEG. Podziel ślady EEG na frakcje 1 godziny. Skopiuj frakcje śledzące EEG do pliku w celu automatycznej analizy spajków oprogramowania.
   4. Analizuj dane dotyczące aktywności EEG za pomocą oprogramowania EEG i predefiniowanych parametrów (4.3.3.). Przeprowadź wszystkie analizy wideo w dwóch niezależnych badaczach, którzy są ślepi na grupę analizowanych zwierząt. W przypadku rozbieżności należy skłonić ich do ponownego przeanalizowania danych, aby wspólnie osiągnąć konsensus.

5. Mikrodializa

1. Odzyskiwanie sondy in vitro
   1. Przygotuj sondę do pierwszego użycia zgodnie z instrukcjami producenta, obsługując ją w pokrowcu ochronnym.
   2. Przeprowadź eksperyment w trzech egzemplarzach: przygotuj trzy probówki o pojemności 1,5 ml, ładując je 1 ml roztworu Ringera zawierającego mieszaninę wzorców (2,5 μM glutaminianu i 2,5 μM asparaginianu). Umieścić trzy załadowane probówki o pojemności 1,5 ml do podgrzewacza bloku ustawionego na 37 °C i umieścić je na mieszadle.
      UWAGA: Używaj tych samych roztworów wzorcowych do kalibracji chromatograficznej.
   3. Uszczelnij probówki o pojemności 1,5 ml folią parafinową i przebij je ostrą pęsetą, aby zrobić otwór o średnicy około 1 mm.
   4. Weź sondę i włóż ją do otworu wykonanego w folii parafinowej. Zanurz membranę co najmniej 2 mm poniżej poziomu roztworu. Przymocuj dalej sondę do probówki o pojemności 1.5 ml za pomocą folii parafinowej.
      UWAGA: Upewnij się, że końcówka nie dotyka ścianek probówki o pojemności 1,5 ml.
   5. Podłącz wlot sondy do strzykawki zamontowanej na pompie infuzyjnej za pomocą rurki fluorowanej etylenu i propylenu (FEP) i adapterów przewodów. Opcjonalnie należy użyć rurki polietylenowej o drobnych otworach o średnicy wewnętrznej (ID) 0,28 mm i średnicy zewnętrznej (OD) 0,61 mm oraz kolorowych adapterów rurek (czerwone i niebieskie adaptery rurek) do połączeń.
   6. Uruchom pompę z prędkością 2 μl/min i pozwól, aby płyn pojawił się na końcówce wylotowej. Podłącz wylot sondy do probówki zbiorczej o pojemności 0.2 ml za pomocą rurki FEP i adapterów przewodów.
      UWAGA: Użyj rurki FEP do wszystkich połączeń. Przytnij żądaną długość rurki za pomocą żyletki. Użyj adapterów rurek w innym kolorze do wlotu i wylotu sondy. Pozwól pompie pracować przez 60 minut. Sprawdź, czy nie ma wycieków i pęcherzyków powietrza. Nie powinny one być obecne.
   7. Ustaw pompę na natężenie przepływu 2 μl/min i zacznij pobierać próbki po stronie wylotowej rurki.
   8. Zebrać trzy 30-minutowe próbki perfuzatu i trzy równe objętości próbki roztworu w probówce o pojemności 1,5 ml. Pobieraj próbki o równej objętości z probówki o pojemności 1,5 ml co 30 minut za pomocą mikrostrzykawki zanurzonej w roztworze wzorcowym w probówce o pojemności 1,5 ml.
   9. Powtórzyć doświadczenie (5.1.1-5.1.8), ustawiając pompę na natężenie przepływu 3 μl/min (5.1.7), aby uzyskać porównanie odzysku sondy przy użyciu dwóch różnych prędkości przepływu perfuzyjnego.
   10. Po zakończeniu zatrzymaj pompę i przepłucz rurkę wodą destylowaną, 70% etanolem i wepchnij do niej powietrze. Sondę należy przechowywać w fiolce wypełnionej czystą wodą destylowaną. Dokładnie wypłucz sondę, przetapiając ją w ilości 2 μl/min wodą destylowaną przed przechowywaniem.
   11. Przeanalizować stężenie glutaminianu i asparaginianu w próbkach metodą chromatografii.
   12. Oblicz odzysk, korzystając z następującego równania:
       Odzysk (%) = (C_perfuzat /C _{dializowany roztwór}) x 100.
2. Sesje mikrodializy u swobodnie poruszających się szczurów
   1. Procedury przygotowawcze: wprowadzenie i testowanie sondy, ustawienie i uruchomienie pompy infuzyjnej
      1. Przygotuj sondy do mikrodializy do pierwszego użycia zgodnie z instrukcją obsługi producenta i napełnij je roztworem Ringera. Wytnij kawałki rurki FEP o długości około 10 cm i podłącz je do kaniul wlotowych i wylotowych sondy za pomocą adapterów rurek w różnych kolorach.
      2. Upewnij się, że rurka styka się z adapterami bez martwych przestrzeni we wszystkich połączeniach.
      3. 24 godziny przed eksperymentem mikrodializy krótko znieczulij zwierzę izofluranem (5% w powietrzu) w komorze indukcyjnej do momentu leżenia. Wyjmij atrapę kaniuli z prowadnicy za pomocą pęsety i mocno przytrzymując głowę zwierzęcia. Włóż sondę do mikrodializy, wyposażoną w membranę dializującą, do kaniuli prowadzącej i dalej dokręć kaniule do mikrodializy wprowadzone do ich prowadnika za pomocą plasteliny.
         UWAGA: Nie pozwól, aby sonda dotykała ścianek ochronnej tulei sondy podczas wyciągania.
      4. Włóż zwierzę do cylindra z pleksi i pozwól mu odkrywać nową atmosferę. Podłączyć zwierzę do systemu rejestracji EEG na uwięzi, jak opisano powyżej (zgodnie z ppkt 4.2.2 i 4.2.3).
      5. Podążaj za obudzonymi i swobodnie poruszającymi się ruchami szczura i podłącz wlot sondy do strzykawki o pojemności 2,5 ml z tępą igłą 22G zawierającą roztwór Ringera za pomocą adapterów rurek. Wepchnij roztwór Ringera do sondy, wyrzucając 1 ml roztworu Ringera w ciągu 10 sekund, naciskając w sposób ciągły tłok strzykawki o pojemności 2,5 ml. Sprawdź, czy na wylocie nie pojawiła się kropla płynu. Sonda jest teraz gotowa do użycia.
      6. Napełnij strzykawki o pojemności 2,5 ml podłączone do rurki FEP za pomocą adapterów przewodów roztworem Ringera i zamontuj je na pompie infuzyjnej. Uruchomić pompę z prędkością 2 μl/min. Pozwól mu działać przez noc.
         UWAGA: Użyj żądanej długości wszystkich rurek FEP, ale oblicz objętość martwą rurki, aby wiedzieć, kiedy należy rozpocząć stymulację o wysokim K⁺ i skorelować dane ilościowe ze zmianami neurochemicznymi w mózgu zwierzęcia. Użyj pęcherzyka powietrza utworzonego w rurce pod przepływem roboczym, aby obliczyć ten czas.
   2. Pobieranie próbek podczas rejestracji EEG i stymulacji potasu
      1. Sprawdź brak napadów w ciągu 3 godzin poprzedzających rozpoczęcie pobierania próbki (zapisy video-EEG) i kontynuuj monitorowanie aktywności napadowej podczas mikrodializy.
      2. Zatrzymać pompę przenoszącą kaniulowane strzykawki z rurką FEP wypełnione roztworem Ringera. Zamontuj na pompie kolejny zestaw strzykawek o pojemności 2,5 ml połączonych z rurką FEP za pomocą adapterów do rurek, wypełnionych zmodyfikowanym roztworem Ringera zawierającym 100 mM roztworu K⁺.
      3. Uruchom pompę z prędkością 2 μl/min i pozwól jej pracować. W celu szybszego napełnienia rurki należy ustawić pompę na 5 μl/min na czas napełniania. Sprawdź, czy w systemie nie ma pęcherzyków powietrza. Upewnij się, że rurka styka się z adapterami bez martwych przestrzeni we wszystkich połączeniach.
      4. Zbadać sondę, jeśli jest gotowa do użycia u zwierząt, jak opisano powyżej (5.2.1.5).
      5. UWAGA: Jeśli z jakiegoś powodu sonda nie działa, zmień ją. W takich przypadkach należy przechowywać kilka przygotowanych sond do mikrodializy gotowych do użycia w pobliżu stacji roboczej mikrodializy EEG. Odłącz zwierzę od kabli EEG i w razie potrzeby znieczulenie go na krótko izofluranem, aby zrealizować zmianę.
      6. Podłącz rurkę FEP strzykawek wypełnionych roztworem Ringera do kaniuli wlotowej sondy w każdym zwierzęciu i poczekaj na pojawienie się kropli płynu na końcówce wylotu.
      7. Podłącz wylot sondy do rurki FEP, co prowadzi do gromadzenia się w probówce. Włóż rurkę FEP do zamkniętej probówki o pojemności 0.2 ml z perforowaną nasadką. Upewnij się, że rurka pozostaje na swoim miejscu, mocując ją kawałkiem plasteliny.
      8. Kontynuować pracę pompy z prędkością 2 μl/min przez 60 minut bez pobierania próbek w celu zrównoważenia systemu (próbka zerowa).
      9. Zebrać 5 kolejnych 30-minutowych próbek dializatu (odpowiednio 60 μl) w warunkach wyjściowych (perfuzja z normalnym roztworem Ringera). Próbki należy przechowywać na lodzie.
      10. Obliczyć czas, w którym płyn przechodzi z pompy do głowy zwierzęcia (zależy to od martwej objętości rurki, tj. czasu pęcherzyków powietrza) i zmienić rurkę FEP, która przechodzi ze strzykawek zawierających normalny roztwór Ringera na strzykawki zawierające zmodyfikowany (100 mM K⁺) roztwór Ringera w tym czasie bez zatrzymywania pompy. Sprawdź, czy w systemie nie ma pęcherzyków powietrza. Pozwól pompie pracować przez 10 minut. UWAGA: Podczas 10 minut stymulacji o wysokim K⁺ zwierzęta mają tendencję do gorączkowego poruszania się i zwykle wykazują dużą liczbę mokrych drgawek psich (zwierzęta grupowe kontrolne i poza napadami) lub napady behawioralne (zwierzęta padaczkowe), więc bądź gotowy do interwencji, aby chronić rurki i kable przed skręcaniem.
      11. Po 10 minutach zmienić rurkę ze strzykawek zawierających 100 mM K⁺ roztworu Ringera na normalny roztwór Ringera i pozostawić pompę do pracy. Nie wyłączaj pompy podczas wymiany roztworu, aby na końcu rurki, która ma być podłączona w linii, znalazła się kropla płynu.
      12. Od momentu, w którym dialilat zawiera wysoką zawartość potasu, tj. po pobraniu piątego dializatu po równowadze, frakcje dializatu należy pobierać co 10 minut (20 μL) przez 1 godzinę. Pobrać 3 dodatkowe próbki dializatu w ciągu 30 minut i zatrzymać pompę. Próbki należy przechowywać na lodzie.
      13. Po zakończeniu doświadczenia próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
      14. Powtórz eksperyment mikrodializy przez 3 kolejne dni, z wyjątkiem grupy z ostrym (24 godziny) i pierwszym napadem, w której tylko jedna sesja mikrodializy ma miejsce 24 godziny po SE lub w ciągu 24 godzin po pierwszym spontanicznym napadzie (Rysunek 3).

Wyniki

Rysunek 1. Przygotowanie urządzenia do wszczepienia krok po kroku. (A) 3-kanałowa elektroda z elektrodą uziemiającą o długości 10 cm w tulei ochronnej po lewej stronie i kaniulą prowadzącą do mikrodializy po prawej potrzebnej do montażu urządzenia. (...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-kanałowa elektroda dwuskrętkowa	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Materiał
kaniula prowadząca	Agn Tho's, Lindigö, Szwecja	MAB 4.15.IC	Materiał
Żywica KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Włochy	KK2	Materiał
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Włochy	2047420_71941	Materiał
Imalgene-Ketamine	Merial, Tuluza, Francja	221300288 (AIC)	Solution
Xylazine	Sigma, Milano, Włochy	X1251	Materiał
Isoflurane-Vet	Merial, Tuluza, Francja	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol	Formevet, Milano, Włochy	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine	MSD Italia, Roma, Włochy	20891077 (AIC)	Materiał
simplex szybki cement dentystyczny	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Wielka Brytania	ACR811	Materiał
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kioto, Japonia	PN1167	Materiał
uchwyt na klips do sondy	Agn Tho's, Lindigö, Szwecja	p/n 100 5001	Equipment
Histoacryl® Blue Topical	Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Materiał
Valium 10 mg/2 ml - diazepam	Roche, Monza, Włochy	019995063 (AIC)	Materiał
1 ml z igłą 25G	Vetrotecnica, Padwa, Włochy	3	Materiał
Elastyczna igła do karmienia szczurów 17G	Agn Tho's, Lindigö Szwecja	7206	Materiał
Aparat do technologii trawy	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, Kalifornia, USA	M665G08	Equipment (wzmacniacz AS40, skrzynka główna, kable połączeniowe, telefactor model RPSA S40)
modułowy system akwizycji i analizy danych MP150	Biopac, Goleta, Kalifornia, USA	MP150WSW	Equipment
cyfrowy system nadzoru wideo	AverMedia Technologies, Fremont, Kalifornia, USA	V4.7.0041FD	Equipment
sonda do mikrodializy	Agn Tho's, Lindigö Szwecja	MAB 4.15.1.Cu	Materiał
sonda do mikrodializy	Synaptech, Kolorado Springs, Kolorado, USA	S-8010	Materiał
grzałka blokowa	Grant Instruments, Cambridge, Anglia	QBD2	Sprzęt
mieszadło	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Włochy	711	Sprzęt
pompa infuzyjna	Univentor, Zejtun, Malta	864	Sprzęt
rurki polietylenowe o cienkim otworze	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Materiał
niebieskie adaptery do rurek	Agn Tho's, Lindigö Szwecja	1002	Materiał
czerwone adaptery rurek	Agn Tho's, Lindigö Szwecja	1003	Materiał
strzykawka 2,5 ml z igłą 22G	Chemil, Padwa, Włochy	S02G22	Materiał
nakrętka fiolki	Cronus, Labicom, Ołomuniec, Czechy	VCA-1004TB-100	Materiał
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm przegroda nosowa TEF/SIL	Materiał
szklana wkładka z dolną sprężyną	Supelco, Sigma, Milano, Włochy	27400-U	Materiał
automatycznego pobierania próbek	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Włochy	C4013-2	Materiał
Sterownik systemu i odgazowywacz Smartline manager 5000	Knauer, Berlin, Niemcy	V7602	Sprzęt
Pompa o nachyleniu czwartorzędowym Smartline 1000	Knauer, Berlin, Niemcy	V7603	Equipment
Skład roztworu Ringera	w mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
zmodyfikowany skład roztworu Ringera	w mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
sól fizjologiczna	0.9% NaCl, ph dostosowana do 7.0		Rozwiązanie
roztwór sacharozy	10% sacharozy w wodzie		Rozwiązanie

destylowanej