Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Streszczenie

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe znakowane złotem są dodawane w celu oznakowania specyficznych receptorów błony neuronalnej. Replika jest zamontowana na siatce i uwidoczniona pod mikroskopem elektronowym.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie próbki

1. Fiksacja mózgu
   1. Przygotowanie utrwalacza
      1. Na 1 L utrwalacza odważ 10 g paraformaldehydu i dodaj go do 300 ml wody dejonizowanej (H₂O). Podgrzewać do 55 - 60 ºC przez ~10 min z ciągłym mieszaniem.
      2. Wyłącz ogień i dodaj 7 - 8 kropli 4 N wodorotlenku sodu (NaOH). Roztwór powinien stać się klarowny w ciągu ~10 minut.
      3. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej lub RT, dodać 150 ml nasyconego roztworu kwasu pikrynowego i doprowadzić do 500 ml za pomocą dejonizowanego H₂O.
      4. Dodać 500 ml 0,2 M buforu fosforanowego (PB). Filtruj bibułą filtracyjną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH.
      5. Schłodzić utrwalacz do temperatury 6 ºC i przechowywać go w butelkach z ciemnego szkła nie dłużej niż jeden dzień w temperaturze 6 ºC.
   2. Perfuzja przezsercowa
      1. Znieczulenie myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia tiopentalu (120 mg/kg masy ciała). Upewnij się, że zwierzę jest głęboko znieczulone, sprawdzając odruch wycofania pedału, który powinien być nieobecny. Połóż zwierzę na plecach na stole perfuzyjnym z przywiązanymi czterema kończynami.
      2. Otwórz ścianę brzucha wzdłużnie nożyczkami z tępym końcem i wykonaj dwa dodatkowe nacięcia boczne wzdłuż ogonowej granicy klatki piersiowej, aby odsłonić przeponę. Odetnij przeponę i przetnij ścianę klatki piersiowej na granicy kostno-chrzęstnej po obu stronach. Podnieś ogonowy koniec środkowej płyty ściany klatki piersiowej zawierającej mostek, aby odsłonić serce.
      3. Usuń osierdzie i wykonaj małe, precyzyjne nacięcie w końcówce lewej komory, aby wpuścić kaniulę aparatu perfuzyjnego. Użyj tępej kaniuli o średnicy wewnętrznej 0,6 mm. Delikatnie przełóż kaniulę przez komorę, aż końcówka pojawi się w aorcie wstępującej, a następnie zabezpiecz kaniulę zaciskiem. Aby krew i perfuzaty mogły wydostać się z krwiobiegu, wykonaj nacięcie w prawym przedsionku.
      4. Perfuzję myszy przekrwić przezsercowo za pomocą pompy perystaltycznej przy natężeniu przepływu 5 ml / min na początku za pomocą buforu fosforanowego soli fizjologicznej lub PBS (25 mM, 0,9% chlorku sodu lub NaCl, pH 7,4) przez około 1 minutę, a następnie chłodzonego lodem utrwalacza przez 7 minut.
      5. Po utrwaleniu odetnij głowę myszy nożyczkami, a następnie przetnij skórę przez linię środkową od szyi do nosa. Usuń mięsień, aby całkowicie odsłonić czaszkę.
      6. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj podłużne cięcie przez kości potyliczne i międzyciemieniowe, zaczynając od otworu wielkiego. Za pomocą cienkiej pęsety usuń te kości, aby odsłonić cały móżdżek. Następnie wykonaj kolejne podłużne cięcie przez kość ciemieniową i czołową aż do kości nosowej i usuń je pęsetą, aby odsłonić cały mózg.
      7. Za pomocą szpatułki usuń mózg, nie uszkadzając go i umieść go w lodowato zimnym 0,1 M PB.
2. Cięcie i przycinanie próbek
   1. Wytnij blok koronalny o wielkości około 5 - 6 mm za pomocą żyletek zawierających obszar zainteresowania. Przyklej go do uchwytu wibrokrajalnicy za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Ustaw blok tkankowy tak, aby kora nowa była skierowana w stronę wibrującego ostrza. Pokrój odcinki koronalne zawierające ciało migdałowate na 140 μm za pomocą wibrokrajalnicy (Rysunek 1A) w lodowatym 0,1 M PB i zbierz je w 6-dołkowym naczyniu w tym samym buforze.
   2. Pod mikroskopem stereoskopowym wytnij obszar zainteresowania (w tym przypadku środkowo-grzbietowe skupisko okołotorebkowe interkalowanych mas komórkowych ciała migdałowatego lub ITC; patrz Rysunek 1B) z wycinka. Zrób to na szalce Petriego pokrytej elastomerem silikonowym i wypełnionej 0,1 M PB, za pomocą skalpela okulistycznego. Upewnij się, że przycięte klocki pasują do otworu w przekładce (około 1,5 mm) (Rysunek 1B).
   3. Przenieś przycięte bloki do roztworu krioprotekcji (30% glicerolu w 0,1 M PB) przez noc (O/N) w temperaturze 6 ºC.

2. Zamrażanie wysokociśnieniowe

UWAGA: Immunoznakowanie repliki zamrażalniczo-łamliwej (FRIL) składa się z 6 podstawowych etapów (Rysunek 2): 1) Szybkie zamrażanie próbki pod wysokim ciśnieniem (przy 2,300 - 2,600 barach). 2) Pękanie próbki. Płaszczyzna pęknięcia na ogół podąża za centralnym hydrofobowym rdzeniem zamrożonych błon, dzieląc je na dwie półbłonowe płatki: połowę, która przylega do protoplazmy (powierzchnia P) i połowę, która przylega do przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub egzoplazmatycznej (powierzchnia E). 3) Replikacja próbki przez próżniowe osadzanie platyny i węgla. 4) Trawienie tkanek detergentami. 5) Znakowanie Immunogold. 6) Analiza repliki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

1. Przygotowanie nośników miedzianych
   UWAGA: Aby przejść przez kolejne etapy procedury FRIL, próbki muszą zostać zamontowane na nośnikach metalowych (złotych lub miedzianych). Nośniki te różnią się wielkością i konstrukcją w zależności od sposobu szczelinowania i rodzaju używanych maszyn. W tym przypadku użyliśmy miedzianych nośników (Rysunek 1B, E) i zawiasowego "stołu podwójnej repliki" (patrz Rysunek 3B), który po otwarciu powoduje pęknięcie rozciągające zamrożoną próbkę (Rysunek 2). Pozwala to na zachowanie i odtworzenie obu stron pękniętej próbki.
   1. Wypoleruj nośniki miedzi za pomocą odpylacza za pomocą arkusza skóry irchowej.
   2. Umieść nośniki w szklanym garnku i wyczyść dwukrotnie niejonowym detergentem (pH ~1,5) w kąpieli wodnej sonikującej, następnie dokładnie umyj w wodzie z kranu, a następnie w wodzie dejonizowanej, a następnie dwukrotnie spłucz etanolem.
   3. Sonikować miedziane nośniki w acetonie przez 15 minut.
   4. Umieść nośniki na bibule filtracyjnej do wyschnięcia.
   5. Przymocuj pierścień taśmy dwustronnej do miedzianego nośnika (Rysunek 1C), który posłuży jako studnia przytrzymująca przycięty blok (nośnik przytrzymujący).
2. Zamrożenie próbki
   UWAGA: Z ciekłym azotem należy obchodzić się ostrożnie i nosić odpowiednie okulary.
   1. Włącz wysokociśnieniową jednostkę zamrażającą (Rysunek 1F) na co najmniej 1,5 godziny przed zamrożeniem próbki.
   2. Rozpocznij podgrzewanie, naciskając przycisk "NAGRZEWNICA POWIETRZNA" i piecz przez 50 minut. Ustaw temperaturę powietrza na 80 °C.
   3. Podłącz zbiornik azotu do zamrażarki wysokociśnieniowej i naciśnij przycisk "AZOT", aby napełnić wnętrze Dewara ciekłym azotem. Zapala się lampka "POZIOM AZOTU". Rozpocznij chłodzenie, naciskając przycisk "Chłodzenie".
   4. Naciśnij przycisk "DRIVE IN", gdy zgaśnie "POZIOM AZOTU". Sprawdź, czy układ hydrauliczny przesuwa tłok do przodu i do tyłu 3 razy.
   5. Naciśnij przycisk "AUTO" i przycisk "AZOT". Gdy tylko zaświeci się "READY", zamrażarka wysokociśnieniowa jest gotowa do zamrażania pod wysokim ciśnieniem.
   6. Umieść przycięty klocek w otworze taśmy dwustronnej (Rysunek 1B) za pomocą pętli z drutu platynowego, która została stopiona w szklanej pipecie.
   7. Usunąć nadmiar roztworu krioprotektantu za pomocą bibuły filtracyjnej lub szczotki.
      UWAGA: Ta procedura jest również ważna w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, które mogą tworzyć się wokół tkanki i które mogą powodować zniekształcenia kształtu tkanki i/lub ultrastruktury.
   8. Pod mikroskopem stereoskopowym przykryj nośnik trzymający innym nośnikiem, tak aby blok tkanki został umieszczony między dwoma nośnikami.
   9. Włóż kanapkę nośną do uchwytu próbki urządzenia do zamrażania wysokociśnieniowego (Rysunek 1D). Włóż uchwyt próbki do zamrażarki wysokociśnieniowej (końcówką do dołu) i zabezpiecz go, wkręcając uchwyt próbki.
   10. Zainicjuj cykl zamrażania, naciskając przycisk "Jet-Auto". Pracując tak szybko, jak to możliwe, wyjmij uchwyt próbki i zanurz końcówkę w ciekłym azocie w izolowanym pudełku. Zanurz końcówki dwóch par kleszczy w ciekłym azocie, aby je schłodzić.
   11. Ostrożnie wyjąć kanapkę nośną z uchwytu na próbkę i umieścić ją we wstępnie schłodzonym kriowiale. Upewnij się, że nośniki są obsługiwane wyłącznie za pomocą kleszczy chłodzonych ciekłym azotem. Kriowiale powinny być perforowane, aby umożliwić wypływ azotu z fiolki (Rysunek 1G).
   12. Powtarzać kroki od 2.2.6 do 2.2.11, aż wszystkie żądane próbki zostaną zamrożone. W tej samej fiolce można przechowywać wiele nośnych kanapek zawierających ten sam rodzaj próbki.
   13. Przechowuj kriowiale zawierające nośniki w kriozbiorniku do czasu replikacji (Rysunek 1H).

3. Freeze-fracture and Replication

1. Przygotowanie dział wiązki elektronów
   1. Przed włożeniem dział wiązki elektronów zdejmij osłonę z "płytą deflektora". Umieść "miernik nastawczy", aby wyśrodkować żarnik w uchwycie tulei zaciskowej przez dolną osłonę katody.
      UWAGA: Końcówka o większej średnicy jest używana do pistoletu węglowego, podczas gdy końcówka o mniejszej średnicy jest przeznaczona do pistoletu platynowego.
   2. Nasuń nowy żarnik na manometr, aż "blaszki ciśnieniowe" będą mogły zacisnąć końce żarnika, upewniając się, że cewka żarnika nie leży pod kątem.
   3. Wyjmij miernik nastawczy i włóż pręt węglowy. Zamocuj go, dokręcając uchwyt tulei zaciskowej uchwytu pręta parownika, upewniając się, że wysokość końca pręta znajduje się pośrodku drugiej cewki od dołu. W przypadku pistoletu platynowego wysokość końca pręta platynowego powinna znajdować się w środku drugiej cewki żarnika od góry.
   4. Wymień płytę deflektora i włóż pistolety do jednostki szczelinowania zamrażającego. Po użyciu wyczyść pistolety piaskarką.
2. Konfiguracja jednostki zamrażania i pękania
   1. Włącz jednostkę szczelinowania zamrażającego (Rysunek 3A), przekręcając MAINS na 1. Szczegółowy opis procedur zamrażania-pękania i replikacji znajduje się w instrukcji obsługi dostarczonej przez producenta.
   2. Przed schłodzeniem urządzenia do zamrażania i szczelinowania należy wypalić cały układ chłodzenia urządzenia ciepłym powietrzem. Naciśnij przycisk "Rozmrażanie" w urządzeniu MTC 010 (jednostka kontrolująca temperaturę) (Rysunek 3A) i pozwól procesowi wypalania działać przez 45 minut.
   3. Aktywuj stację próżniową. Jednostka zamrażająco-szczelinowa zwykle pracuje w zakresie próżni ~10^-6 - 10^-7 mbar.
   4. Napełnij zbiornik azotu i podłącz go do jednostki szczelinowania zamrażającego. Sprawdź, czy uchwyt zaworu jest suchy, a także wyczyść wejście do zbiornika przed włożeniem uchwytu zaworu (wilgotność może zakłócać podciśnienie i wskazanie napełnienia zbiornika N₂).
   5. Chłodzenie należy rozpocząć od ustawienia temperatury na -115 °C. Chłodzenie trwa około 45 minut.
   6. Włóż pistolety elektronowe i dostosuj prąd i napięcie, aby osiągnąć następujące parametry parowania:
      Pistolet węglowy: włączony, pozycja 90°, szybkość akumulacji węgla 0,1 - 0,2 nm/s
      Pistolet węglowo-platynowy: obrót wyłączony, pozycja 60°, szybkość akumulacji 0,06 - 0,1 nm/s
      UWAGA: Jeśli pistolet jest używany po raz pierwszy po wymianie pręta węglowego lub platynowego, odgazuj go przez 3 minuty przed użyciem.

3. Szczelinowanie i replikacja

   1. Włóż zamrożone kanapki z nośnikiem do stołu z podwójną repliką, upewniając się, że wszystkie manipulacje są wykonywane w ciekłym azocie.
   2. Przenieś stół z podwójną repliką do naczynia Dewara i przymocuj go do odbiornika stage'a próbki pod kątem 45°. Poziom ciekłego azotu powinien zawsze znajdować się powyżej stołu podwójnej repliki.
   3. Podnieś stół z podwójną repliką za pomocą manipulatora stołowego i włóż go do jednostki szczelinowania zamrażającego na zimny scenę. Odczekaj około 20 minut, aby temperatura stołu podwójnej repliki dostosowała się do -115 °C.
   4. Sprawdź, czy próżnia jest poniżej 10^-6 mbar, a temperatura wynosi -115 °C.
   5. Złam tkankę, ręcznie obracając koło połączone z osłoną umieszczoną nad stołem podwójnej repliki w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Kiedy całun się obraca, zmusza stół do podwójnej repliki do otwarcia, powodując pęknięcie tkanki.
   6. Naciśnij przycisk "Wysokie napięcie" w urządzeniu EVM 030 (jednostka sterująca parowaniem wiązką elektronów) jednostki zamrażania-pękania (Rysunek 3A).
   7. Odtworzyć odsłonięte powierzchnie pękniętej tkanki (Rysunek 3C) poprzez odparowanie węgla (obracanie się) za pomocą pistoletu elektronowego ustawionego pod kątem 90° do grubości 5 nm, a następnie jednokierunkowe cieniowanie platyną-węglem pod kątem 60° do grubości 2 nm. Na koniec nałóż warstwę węgla o grubości 15 nm pod kątem 90° (obracając).
   8. Użyj następujących parametrów do parowania:
      1. węgiel: obrót włączony, pozycja 90°; prędkość 0,1 - 0,2 nm/s; 5 nm
      2. węgiel-platyna: pozycja 60°; prędkość 0,06 - 0,1 nm/s; 2 nm
      3. węgiel: włączony, pozycja 90°; prędkość 0,3 - 0,5 nm/sek.; 15 nm
   9. Usuń powtórzone próbki z jednostki szczelinowania zamrażającego i przenieś je na ceramiczną płytkę 12-dołkową (Rysunek 4A) wypełnioną TBS (sól fizjologiczna buforowana tris, pH 7,4).
   10. Za pomocą walcówki z platynową pętlą usuń zduplikowaną tkankę z nośnika próbki (Rysunek 4A).
   11. Powtarzać kroki od 3.3.1 do 3.3.10, aż wszystkie próbki zostaną powtórzone.

   4. Trawienie repliki przez SDS

   1. Przenieść replikę do 4 ml szklanej fiolki wypełnionej 1 ml buforu do trawienia SDS (2,5% laurylosiarczan sodu, 20% sacharoza w 15 mM Tris, pH 8,3). Trawienie przez 18 godzin w temperaturze 80 °C z wytrząsaniem (45 uderzeń/min).
   2. Przenieś repliki do nowej probówki wypełnionej buforem do mineralizacji SDS i przechowuj w RT.

4. Znakowanie immunologiczne

UWAGA: Wszystkie inkubacje przeprowadza się w RT z delikatnym wstrząsaniem, z wyjątkiem inkubacji z przeciwciałami.

1. Myć replikę przez 10 minut w świeżym buforze do wytrawiania z dodecylosiarczanu sodu (SDS).
2. Przemyć replikę raz 2,5% BSA (albumina surowicy bydlęcej) w soli fizjologicznej buforowanej tris lub TBS przez 5 minut, a następnie 3 x 10 minut 0,1% BSA w TBS.
3. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania w TBS za pomocą 5% BSA przez 1 godzinę.
4. Zastosuj przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w 2% BSA-TBS. Inkubacje należy wykonywać w kropli o objętości 30 μl (Rysunek 4B) w wilgotnej komorze w temperaturze 15 °C przez 72 godziny (Rysunek 4C).
   1. W tym badaniu należy przetworzyć obie repliki z uszkodzonej tkanki. Inkubować jedną replikę z poliklonalnym przeciwciałem świnki morskiej podniesionym przeciwko aminokwasom 717 - 754 mysiego GluR1 wspólnemu dla wszystkich receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego lub podjednostek AMPA-R (rozcieńczenie: 1:200) lub mysiego przeciwciała monoklonalnego podniesionego przeciwko rekombinowanemu białku fuzyjnemu pokrywającemu aminokwasy 660 - 811 podjednostki NR1 receptora N-metylo-D-asparaginianu lub NMDA-R (rozcieńczenie: 1:500) oraz królicze przeciwciało poliklonalne podniesione przeciwko białku zielonej fluorescencji (rozcieńczenie: 1:300).
   2. Drugą replikę inkubować z króliczym przeciwciałem poliklonalnym podniesionym przeciwko syntetycznemu peptydowi odpowiadającemu aminokwasom 384 - 398 receptora opioidowego szczura μ (rozcieńczenie: 1:500).
5. Prać w TBS z 0,05% BSA (3 x 5 min.).
6. Zastosuj przeciwciała drugorzędowe. W tym badaniu należy użyć przeciwciał sprzężonych ze złotem (5 nm dla jonotropowych receptorów glutaminianu, 10 dla receptorów μ-opioidowych i/lub 15 nm dla żółtego białka fluorescencyjnego Channelrhodopsin-2 lub ChR2-YFP) rozcieńczonych w TBS z 2% BSA. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:30 i inkubować w kropli 30 μl w temperaturze 15 °C O/N.
7. Przemyć 3 x 5 min w 0,05% BSA-TBS w RT.
8. Przemyć 2 x 5 min w ultraczystej wodzie.
9. Zamontuj replikę na pokrytej formvarem 100-liniowej siatce prętów równoległych (Rysunek 4D).

Wyniki

Rysunek 1. Przygotowanie tkanek i zamrażanie pod wysokim ciśnieniem. (A) Vibroslicer służy do cięcia tkanki. (B) Powstały w ten sposób wycinek mózgu myszy koronalnej zawierający ciało migdałowate jest pokaz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przygotowanie tkanek
Paraformaldehyd EM grade	Agar Scientific Ltd., Wielka Brytania	AGR1018
Nasycony roztwór kwasu pikrynowego	Sigma-Aldrich, USA	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Niemcy	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, Niemcy	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Niemcy	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, Niemcy	T198.1
Thiopental	Sandoz, Austria	5,133
Glicerol	Sigma-Aldrich, USA	G5516-500ML
GenPure ultraczysty system wodny	Thermo Fisher Scientific, USA	50131235
Pompa perystaltyczna	ISMATEC, Niemcy	ISM 930C
Papier filtracyjny	MACHEREY-NAGEL, Niemcy	MN 615 1/4
Wibrokrajalnica, VT1000S	Leica Microsystems, Austria
Skalpel okulistyczny	Alcon Laboratories, Stany Zjednoczone
Kaniula perfuzyjna	Vieweg, Niemcy	F560088-1
Zamrażanie wysokociśnieniowe
Nośniki miedzi	Biuro Inżynierskie M. Wohlwend, CH	528
Sidol Polish	Henkel, Niemcy
Skóra irchowa	Sklep z artykułami gospodarstwa domowego
Dziurkacz, 1,5mm	Stubai, Austria
Etanol denaturowany	Donauchem, Austria
Aceton	Roth, Niemcy	9372.5
Wysokociśnieniowa maszyna do zamrażania HPM 010	BalTec, CH; teraz Leica Microsystems	HPM010
Mikroskop stereoskopowy	Olympus, Japonia	SZX10
Ciekły azot
Krofiolki	Roth, Niemcy	E309.{}} 1
CryoCane	Nalge Nunc International,USA	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International,USA	5016-0001
Zbiornik do przechowywania ciekłego azotu	Cryopal, Francja	GT38
Niejonowy detergent (Lavocid)	Werner & Mertz Professional, Niemcy
Zamrażanie i replikacja
Piaskarka, Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, Niemcy	SANDURET 2-K
Węglik krzemu SIC 360, wielkość ziarna 25 - 21μ	JOKE Joisten & Kettenbaum, Niemcy	955932
Zamrażanie systemu pękania BAF 060	BalTec, CH; teraz Leica Microsystems	BAF060
Ceramiczna płytka 12-dołkowa	Gröpel, Austria	14511
Trizma base	SIGMA, USA	T1503
Trizma chlorowodorek	SIGMA, USA	T3253
Chlorek sodu	Merck, Niemcy	1,06,40,41,000
SDS, Sodium lauryl sulfate	Roth, Niemcy	5136.1
Sacharoza{	Merck, Niemcy	1,07,68,71,000
TRIS	Roth, Niemcy	5429.3
Uniwersalny piec do hybrydyzacji	Spoiwo, Niemcy	7001-0050
Immunolabelling
BSA	SIGMA, USA	A9647
Przeciwciało anty-GFP	Sondy molekularne, USA	A11122
Przeciwciało anty-pan-AMPAR	Frontier Institute, Japonia	pan AMPAR-GP-AF580-1
Przeciwciało anty-NMDAR1, klon 54.1	Merck Millipore, Niemcy	MAB363
Przeciwciało Opioid Receptor-Mu (MOR)	ImmunoStar, USA	24216
EM koza anty-świnka morska, 5nm; przeciwciało wtórne	BBInternational,	EM. GAG5
EM kozioł anty-królik, 15nm; przeciwciało wtórne	BBInternational,	EM. GAR15
Osioł anty-królik, 10nm, przeciwciało wtórne	AURION, Holandia	DAR 10nm
Siatki miedziane, 100 Parallel Bar	Agar scientific, UK	G2012C
Inkubator	Major Nauka, USA	MO-RC
Proszek Pioloform	Agar scientific, UK	R1275
Chloroform	Roth, Niemcy	3313.1

}