Artykuł metodologiczny

Ilościowe oznaczenie progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny

14.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3148

⸱

28 listopada 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology & Bioinformatics, California State University Channel Islands, 2Department of Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Beckman Research Institute of City of Hope, 3The Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano trójwymiarowy test kolonogenny, który pozwala progenitorom o fenotypie trzustkowym na różnicowanie się w kolonie wykazujące ekspresję insuliny. Metoda ta wykorzystuje półstałe podłoża zawierające metylocelulozę, Matrigel oraz czynniki wzrostu, w których pojedyncze komórki progenitorowe proliferują i różnicują się in vitro, co umożliwia ilościowe określenie liczby funkcjonalnych progenitorów w populacji.

Streszczenie

Dziedzina biologii komórek macierzystych i progenitorowych trzustki była ograniczana przez brak funkcjonalnych i ilościowych testów in vitro, które umożliwiałyby analizę pojedynczych komórek. Analizy pojedynczych progenitorów mają krytyczne znaczenie, ponieważ stanowią one rozstrzygający sposób na jednoznaczne wykazanie potencjału linii komórkowej poszczególnych progenitorów. Choć opracowano metody generowania „pankreatosfer” w kulturze zawiesinowej z pojedynczych komórek, istnieje kilka ograniczeń. Po pierwsze, osadzanie pojedynczych komórek dla dużej ich liczby jest czasochłonne, co z kolei wymaga dużych objętości pożywek hodowlanych i przestrzeni. Po drugie, liczenie powstałych pankreatosfer jest pracochłonne, zwłaszcza gdy częstotliwość występowania progenitorów inicjujących tworzenie pankreatosfer jest niska. Po trzecie, test pankreatosfer nie jest wydajną metodą pozwalającą na jednoczesną proliferację i różnicowanie progenitorów trzustki w tym samym dołku hodowlanym, co ogranicza użyteczność tego badania.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano i zaprezentowano w niniejszym raporcie test kolonijny dla progenitorów trzustki oparty na podłożu półstałym. Metoda ta wykorzystuje istniejącą koncepcję testu kolonijnego dla komórek krwiotwórczych, w której metyloceluloza służy do nadania lepkości podłożu, co pozwala komórkom progenitorowym pozostać w przestrzeni trójwymiarowej podczas proliferacji oraz różnicowania. Aby wzbogacić populację progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny z heterogenicznej populacji komórek, wykorzystano komórki wykazujące ekspresję neurogeniny (Ngn) 3, która jest markerem komórek progenitorowych endokrynnych trzustki. Komórki wykazujące ekspresję Ngn3 pochodzące z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES), znakowane reporterem wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego, zostały posortowane, a następnie do studni płytek hodowlanych o niskim stopniu przylegania (24-dołkowych) wysiano do 25 000 komórek na studnię. Każda studnia zawierała 500 μL podłoża półstałego z następującymi głównymi składnikami: metylocelulozą, Matrigelem, nikotynamidem, eksendyną-4, aktywinią βB oraz pożywką warunkowaną pobraną z komórek trzustkopodobnych pochodzących z mysich komórek ES. Po 8 do 12 dniach hodowli utworzyły się kolonie wykazujące ekspresję insuliny o charakterystycznej morfologii, które można było poddać dalszej analizie pod kątem ekspresji genów trzustki za pomocą ilościowej RT-PCR oraz barwienia immunofluorescencyjnego w celu określenia składu linii każdej kolonii.

Podsumowując, opracowany przez nas test kolonogenny umożliwia łatwą detekcję i kwantyfikację funkcjonalnych komórek progenitorowych w heterogenicznej populacji komórek. Ponadto format półstałych podłoży zapewnia równomierne dostarczanie komponentów macierzy zewnątrzkomórkowej oraz czynników wzrostu do komórek, co pozwala progenitorom na proliferację i różnicowanie in vitro. Test kolonogenny ten stwarza wyjątkowe możliwości prowadzenia badań mechanistycznych nad komórkami progenitorowymi trzustki na poziomie pojedynczej komórki.

Protokół

1. Różnicowanie mysich komórek ES do komórek przypominających komórki trzustki in vitro w celu wytworzenia pożywki warunkującej (CM) do testu kolonogennego

Procedury dotyczące utrzymania mysich komórek ES, tworzenia ciał embrioidalnych (EB) w hodowli zawiesinowej oraz hodowli przylegającej w celu dalszej różnicowania zostały opisane wcześniej1-3 i nie stanowią głównego tematu niniejszego raportu. Schematyczne przedstawienie kroków zawartych w naszym protokole różnicowania pokazano na Rysunku 1.

Aby uzyskać wysokiej jakości pożywkę warunkowaną, ważne jest, aby w pierwszej kolejności wygenerować 6-dniowe ciała embroidalne (EB), z których co najmniej 30-40% osiągnęło średnicę co najmniej 150 μm. Większe EB powinny wykazywać ciemne punkty w badaniu pod mikroskopem świetlnym, co sugeruje nasiloną różnicowanie (Rysunek 2). Wybór wysokiej jakości płodowej surowicy cielęcej (FCS) jest kluczowy dla wytworzenia takich EB. Partie wysokiej jakości FCS są selekcjonowane na podstawie ich zdolności do wspierania różnicowania EB w kierunku ekspresji genów insuliny 1, glukagonu i amylazy 2A w późniejszych etapach (dni 18-20), co jest wykrywane za pomocą analizy RT-PCR. Ponadto, podczas przenoszenia 6-dniowych EB z hodowli zawiesinowej do hodowli przylegającej (około 80 - 100 EB na dołek w płytkach 6-dołkowych), ważne jest delikatne obracanie płytek w celu zgromadzenia 6-dniowych EB w centrum dołków. Z nieznanych przyczyn zabiegi zwiększające kontakty międzykomórkowe skutkują lepszym rozwojem komórek pancreatic-like z EB w kolejnym etapie hodowli przylegającej.

  1. W 13. dniu hodowli zastąpić pożywkę do adhezji (DMEM/F-12 (1:1), 15% knockout serum replacement, 2 mM L-glutamine, 50 U/mL penicillin, 50 μg/mL streptomycin) świeżą pożywką do adhezji zawierającą 10 mM nikotynamidu, 0,1 nM exendin-4 oraz 10 ng/mL ludzkiej rekombinowanej activin ßB (wszystkie stężenia są stężeniami końcowymi).
  2. W 16. dniu hodowli zebrać pożywkę z kroku 1.1 i przefiltrować ją przez membranę z polietersulfonu o rozmiarze porów 0,2 μm. Od tego momentu zebrana pożywka będzie określana jako pożywka kondycjonowana (CM). Rozdzielić CM do probówek Falcon 15 mL i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu rozpoczęcia hodowli w warunkach półstałych (patrz Sekcja 3 poniżej).

2. Uzyskiwanie progenitorów przypominających komórki trzustki w zawiesinie jednokomórkowej przy użyciu sortera komórek aktywowanego fluorescencją

Linię mysich komórek ES typu knock-in,4 oznaczoną jako Ngn3-EGFP, w której gen reporterowy EGFP zastąpił jeden allel locus Ngn3, różnicowano zgodnie z wcześniejszym opisem.2 Ngn3 jest czynnikiem transkrypcyjnym zawierającym motyw basic helix-loop-helix (bHLH), wyrażanym przez progenitorów endokrynnych trzustki podczas rozwoju.5 Kultury w 16. dniu zazwyczaj sortowano w celu uzyskania zróżnicowanych komórek Ngn3-EGFP+ oraz Ngn3-EGFP-.1,2

  1. Dysocjacja zróżnicowanych komórek do zawiesiny pojedynczych komórek.
    1. Inkubować 16-dniowe hodowle z 0,25% trypsyną-EDTA (3 min, 37°C), aby odłączyć komórki od dołków hodowlanych.
    2. Dodać 10% FCS, aby zatrzymać aktywność trypsyny.
    3. Przemyć komórki fosforanem buforowanym solą fizjologiczną (PBS) wolnym od magnezu i wapnia, zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), a następnie wirować przy 300 x g przez 5 min.
    4. Usunąć nadosad i inkubować agregaty komórkowe z 4 mg/mL kolagenazy B oraz 2000 U/mL doksyrybonukleazy (DNase) I (30 min, 37°C), aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Używać pipety 1000 μL do rozbijania osadów komórkowych co 10 min w celu przyspieszenia procesu dysocjacji.
    5. Przemyć komórki PBS zawierającym 0,1% BSA i wirować przy 300 x g przez 5 min.
    6. Usunąć nadosad i resuspendować komórki w PBS zawierającym 0,1% BSA.
  2. Przygotowanie komórek do sortowania.
    1. Dodać 2 μL DNase I (1 MU/ mL) na każdy mL zawiesiny komórkowej, aby zapobiec ponownej agregacji komórek podczas sortowania.
    2. Przepuścić zawiesinę pojedynczych komórek przez sito o oczkach od 40 do 70 μm, aby usunąć duże agregaty komórkowe.
    3. Dodać DAPI (stężenie końcowe 1 μg/mL) do zawiesiny pojedynczych komórek.
    4. Nabyć dane z cytometrii przepływowej na sorterze komórek. W niniejszym raporcie wykorzystano sorter komórek MoFlo MLS (Beckman Coulter).
    5. Gating populacji komórek do sortowania. Komórki Ngn3-EGFP+ oraz Ngn3-EGFP- są najpierw bramowane (gating) według rozproszenia przedniego względem rozproszenia bocznego (Rycina 3A), następnie DAPI względem rozproszenia bocznego (Rycina 3B), szerokości impulsu względem rozproszenia bocznego (Rycina 3C), a na koniec FL1 względem autofluorescencji (Rycina 3D). Końcowa brama sortowania komórek Ngn3-EGFP+ jest celowo przesunięta w prawo (Rycina 3E; strzałka), aby ograniczyć zanieczyszczenie komórkami Ngn3-EGFP- podczas sortowania. Do bramowania kontroli negatywnej można użyć 6-dniowych ciał embroidalnych (EB) z linii ES Ngn3-EGFP lub 16-dniowej hodowli na tym samym etapie z linii nietransgenicznej, np. komórek ES TL1 (Rycina 3D, panel lewy).
  3. Posortować komórki Ngn3-EGFP+ i Ngn3-EGFP-.

3. Wysiewanie posortowanych komórek na pożywkę półpłynną

  1. Przygotowanie Matrigelu.
    1. Rozdzielić Matrigel na aliquoty po 1 mL na probówkę i przechowywać w temperaturze -20°C do czasu użycia.
    2. Zamrożone aliquoty należy umieścić w temperaturze 4°C przez noc lub na lodzie przez 3 godziny w celu rozmrożenia bezpośrednio przed użyciem. Rozmrożone aliquoty muszą pozostać na lodzie podczas przygotowywania kultury półstałej, aby uniknąć ponownego zestalenia.
  2. Przygotowanie roztworu metylocelulozy (3,3%).
    Proszku metylocelulozy nie można autoklawować. Aby uzyskać wolny od bakterii roztwór metylocelulozy, podczas procesu przygotowania należy używać czystych łódeczek wagowych oraz autoklawowanych mieszadełek magnetycznych, zlewów, kolb i innych akcesoriów.
    1. Na jeden dzień przed przygotowaniem roztworu metylocelulozy przechowywać 200 mL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej w temperaturze 4°C. Należy również przygotować 500 mL podłoża 2x DMEM/F12 (poprzez rozpuszczenie proszku DMEM/F-12 w wodzie dwukrotnie destylowanej) zawierającego 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny i przechowywać w temperaturze 4°C.
    2. W dniu przygotowania metylocelulozy dodać 500 mL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej do szklanego zlewka o pojemności 1000 mL przykrytego folią aluminiową. Gotować przez co najmniej 30 min, aby usunąć z wody pęcherzyki powietrza.
    3. Umieścić duży mieszadełko magnetyczny (o długości co najmniej 3 cali) w szklanej kolbie o pojemności 2000 mL.
    4. Odmierzyć 300 mL wrzącej wody i przelać ją do kolby.
    5. Umieścić kolbę na mieszadle magnetycznym (bez podgrzewania). Powoli mieszać gorącą wodę, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.
    6. Odważyć 33 g proszku metylocelulozy i bardzo powoli dodać go do gorącej wody. Gorąca woda jest niezbędna do efektywnego zwilżenia proszku metylocelulozy i ułatwienia późniejszego rozpuszczania w niskiej temperaturze.
    7. Kontynuować mieszanie proszku, aż temperatura spadnie do około 40-45°C.
    8. Dodać 200 mL zimnej sterylnej wody dwukrotnie destylowanej do chłodzącej się mieszaniny metylocelulozy. Natychmiast po tym roztwór powinien stać się przezroczysty i lepki, co wskazuje na rozpuszczanie się metylocelulozy w fazie wodnej. Kolbę należy zakręcić ręcznie, aby upewnić się, że roztwór jest dokładnie wymieszany.
    9. Dodać 500 mL zimnego podłoża 2x DMEM/F12. Kontynuować mieszanie poprzez ręczne obracanie kolby.
    10. Umieścić kolbę na mieszadle w pomieszczeniu chłodniczym i powoli mieszać roztwór metylocelulozy przez 24-48 godzin.
    11. Rozdzielić roztwór na aliquoty po 125 mL do butelek do przechowywania i przechowywać w temperaturze -20°C. Próbkę należy nanieść na sterylną szalkę Petriego i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C w celu sprawdzenia sterylności. Rozmrożony roztwór metylocelulozy można przechowywać w lodówce do 2 miesięcy.
  3. Przygotowanie pożywki kondycjonowanej.
    Rozmrozić CM (patrz sekcja 1) bezpośrednio przed użyciem. Przechowywać CM na lodzie przez cały czas przygotowania kultury półstałej.
  4. Przygotować następujące czynniki wzrostu: 1,0 M nikotynamid, 0,1 μM exendin-4, 10 μg/mL rekombinowaną ludzką aktywinę βB oraz 10 μg/mL VEGF-A. Nikotynamid i exendin-4 przechowywać w temperaturze -20°C, a aktywinę βB i VEGF-A w temperaturze -80°C, i rozmrażać bezpośrednio przed użyciem. Wszystkie składniki podłoża do kultury półstałej powinny być przechowywane na lodzie podczas wysiewania. Należy zauważyć, że dodanie VEGF-A okazało się później niepotrzebne do tworzenia kolonii.2
  5. Przygotowanie płodowej surowicy cielęcej. FCS powinna zostać inaktywowana termicznie przed użyciem. Inkubować FCS przez 30 minut w temperaturze 56°C w łaźni wodnej, aby inaktywować białka dopełniacza. Jeśli początkowa butelka z zapasem FCS zawiera więcej niż 500 mL, należy rozdzielić ją na fiolki po 125 mL. Zwiększona powierzchnia zapewni równomierne i dokładne ogrzanie całej objętości. Pozostawić butelki do ochłodzenia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę przed przechowywaniem w -20°C. Rozmrożony FCS filtruje się przez filtr 0,2 μm przed użyciem.
  6. Mieszanie składników kultury z posortowanymi komórkami.
    Przez cały czas przygotowania komórki i wszystkie składniki podłoży półstałych należy przechowywać na lodzie, aby zapobiec zestaleniu Matrigelu. Wszystkie akcesoria mające kontakt z Matrigelem, w tym końcówki do pipet, strzykawki i igły, powinny być zimne. Należy umieścić te akcesoria w temperaturze -20°C co najmniej pół godziny przed użyciem.
    1. Określić liczbę komórek do wysiania na studzienkę w płytce 24-dołkowej. Na jedną studzienkę płytki 24-dołkowej można wysiać do 25 000 komórek. W początkowych eksperymentach można przeprowadzić miareczkowanie gęstości komórek, aby określić optymalną liczbę wysiewanych komórek.
    2. Dodać składniki kultury do polistyrenowej probówki 5 mL z nakrętką zatrzaskową w kolejności opisanej w Tabeli 1 (należy pamiętać, że komórki dodaje się na końcu, aby uniknąć przedwczesnej stymulacji). Najpierw dodać 3,3% metylocelulozy do probówek polistyrenowych, a na końcu posortowane komórki. Należy pamiętać, że roztwór 3,3% metylocelulozy należy pobrać i dodać do probówek polistyrenowych za pomocą igły o rozmiarze 16 ½ G i odpowiednio oznakowanej strzykawki graduowanej. Generalnie, aby prawidłowo odmierzyć objętość roztworów lepkich, takich jak roztwór 3,3% metylocelulozy i końcowa mieszanina kultury, ważne jest, aby najpierw zassać trochę roztworu do strzykawki, a następnie natychmiast go wypchnąć, aby usunąć powietrze. Roztwór 3,3% metylocelulozy można ogrzać do temperatury pokojowej, jeśli trudno go jest pobrać. Należy jednak upewnić się, że zostanie on schłodzony na lodzie po przelaniu do probówek polistyrenowych i przed dodaniem Matrigelu.
  7. Wysiewanie podłoża półstałego zawierającego posortowane komórki.
    1. Po upewnieniu się, że nakrętki probówek polistyrenowych są szczelnie zamknięte, energicznie i dokładnie wstrząsnąć probówkami ręcznie. W tym procesie powstaną pęcherzyki powietrza.
    2. Umieścić probówki na lodzie na 5 min lub do czasu wypłynięcia małych pęcherzyków powietrza na powierzchnię.
    3. Użyć strzykawki 1 mL z igłą o rozmiarze 16 ½ lub 18 ½ G do aspiracji zawartości. Postępować zgodnie z zaleceniami w punkcie 3.6.2, aby pobrać dokładną objętość lepki roztworu bez powietrza w strzykawkach.
    4. Powoli nanieść 500 μL podłoża do każdej studzienki 24-dołkowej. Należy używać wyłącznie płytek 24-dołkowych o niskim przywieraniu (low attachment). Podłoże nanosić bezpośrednio do centrum studzienki. Podłoże półstałe automatycznie rozprzestrzeni się w studzienkach. Dla każdej próbki eksperymentalnej rutynowo stosuje się cztery powtórzenia (quadruplicate) w celu uzyskania statystycznie istotnych wyników. Do hodowli wykorzystuje się tylko 4 wewnętrzne kolumny poziomo zorientowanej płytki 24-dołkowej. Pozostałe studzienki należy wypełnić sterylną wodą, aby wspomóc uwilgotnienie kultury zawierającej komórki.
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2.
    6. Odroczone dodawanie czynników wzrostu. Możliwe jest dodanie czynników wzrostu po zainicjowaniu kultury. Takie zabiegi mogą być stosowane w celu zbadania efektów przeżywalności związanych z określonymi czynnikami wzrostu. Roztwory czynników wzrostu w objętości do 100 μL na studzienkę można nanieść kroplowo za pomocą strzykawki 1 mL z igłą 26 G 3/8 i pozwolić im dyfundować do podłoża półstałego.

4. Obserwacja formowania się kolonii pod mikroskopem świetlnym

Komórki należy obserwować bezpośrednio po wysiewie, aby upewnić się, że pojedyncze komórki są rozłożone w studniach w sposób losowy i równomierny. Jeśli większość komórek lub powstałe kolonie skupiają się przy krawędziach studni, świadczy to o zbyt gwałtownym dozowaniu półstałego podłoża do studni (patrz rozdział 3.7.4). Ze względu na efekt menisku, gęstość kolonii przy krawędziach studni hodowlanych może być wyższa w porównaniu do tych znajdujących się w centrum.

  1. Ilościowe oznaczanie liczby kolonii. Ze względu na trójwymiarowy charakter podłoża, kolonie będą widoczne w różnych płaszczyznach ogniskowania. W związku z tym podczas obserwacji pod mikroskopem świetlnym może być konieczna regulacja ostrości dla każdej kolonii. Aby uniknąć dwukrotnego zliczenia tej samej kolonii, podczas liczenia należy umieścić pod płytką 24-dołkową siatkę. Siatkę można uzyskać, wycinając ściankę szalki Petriego NUNC (nr kat. 169558). Do obserwacji i liczenia kolonii należy użyć obiektywu 10x w mikroskopie świetlnym.

5. Reprezentatywne wyniki:

Poprzednie eksperymenty wykazały, że rozpoczynając od 2,5 x 105 mysich komórek ES R1 (w łącznej objętości 50 mL medium), można oczekiwać uzyskania około 5000 ciałek embrionalnych (EB) o odpowiedniej wielkości w 6. dniu. Komórki ES Ngn3-EGFP były mniej wydajne; do uzyskania EB o podobnej wielkości w 6. dniu wymagano 4-krotnie większej liczby komórek. Ponieważ 25 EB w 6. dniu zawiera średnio 1,88 ± 0,67 x 105 komórek,1 z 5000 EB można uzyskać około 37,6 x 106 komórek. Podczas hodowli przylegającej oczekuje się 2,72 ± 0,32-krotnego namnożenia komórek.1 Zatem 5000 EB w 6. dniu dostarczy około 100 x 106 komórek w 16. dniu przed sortowaniem. Po bramkowaniu komórki Ngn3-EGFP+ będą stanowić około 10% całkowitej populacji komórek w 16. dniu (Tekst protokołu sekcja 2.2.5 oraz Rysunek 3).

Przykład fotomikrografii kolonii wykazujących ekspresję insuliny, pochodzących z mysich komórek ES, przedstawiono na Ryc. 4. Kolonie te mają charakterystyczną morfologię; są to małe (~60-100 μm), okrągłe kolonie, w których poszczególne komórki są małe, ciemne i nieodbijają światła. W naszej poprzedniej publikacji,2 analiza RT-PCR w czasie rzeczywistym oraz podwójne barwienie immunofluorescencyjne pojedynczo wyselekcjonowanych kolonii wykazały ekspresję insuliny, C-peptydu oraz glukagonu. Wyniki te demonstrują zdolność pojedynczych komórek Ngn3-EGFP+ do różnicowania się w komórki jednocześnie zawierające co najmniej dwa hormony wyspowe, co przypomina prymitywne komórki endokrynne charakterystyczne dla pierwszej fali różnicowania.

Test tworzenia kolonii dla rozproszonych pojedynczych komórek umożliwia badanie progenitorów, które mają zdolność do inicjowania proliferacji i różnicowania in vitro (Rysunek 5). W związku z tym jest to test, który pozwala zmierzyć wewnętrzną funkcję poszczególnych komórek progenitorowych. Progenitory posiadające zdolność przekształcania się w kolonie wykazujące ekspresję insuliny nazywa się jednostkami tworzącymi kolonie wykazujące ekspresję insuliny (ICFUs) (Rysunek 5). Zgodnie z koncepcją, według której Ngn3 znakuje komórki progenitorowe endokrynne w rozwijającej się trzustce,5 komórki Ngn3-EGFP+, a nie Ngn3-EGFP- z populacji pochodzących z komórek mES, są wzbogacone w ICFUs.2 Jednakże częstotliwość występowania tych progenitorów jest wciąż niska; około 0,1% do 0,6% całkowitej populacji Ngn3-EGFP+ wyizolowanej z hodowli w 16. dniu to ICFUs.2 Mimo to oczekiwana jest wyraźna różnica w wydajności tworzenia kolonii, przy czym najwyższą wykazują komórki Ngn3-EGFP+, następnie komórki nieposortowane, a na końcu komórki Ngn3-EGFP-.

Schemat osi czasu różnicowania; etapy hodowli EB; fazy z surowicą i bezsurowicze; sortowanie komórek.
Rycina 1. Oś czasu różnicowania mysich komórek ES do komórek podobnych do trzustkowych in vitro. W celu otrzymania pożywki warunkowanej (CM), mysie komórki ES hoduje się w zawiesinie z 15 % FCS przez pierwsze sześć dni, stosując malejące dawki monotio glicerolu (6,0 x 10-3 M przez pierwsze dwa dni i 6,0 x 10-4 M przez kolejne cztery dni), aby utworzyć ciała embroidalne (EB). Następnie EB z 6. dnia (80–100 na studzienkę) przenosi się do przylegających płytek 6-dołkowych zawierających 15 % knockout serum replacement. Między 6. a 10. dniem hodowli można dodać 5% FCS, aby przyspieszyć przyleganie EB. Następnie w 13. dniu hodowli do pożywki dodaje się nikotynamid, eksendynę-4 oraz ludzką rekombinowaną aktywinę βB (patrz sekcja 1.1). Pożywkę zbiera się w 16. dniu hodowli, kiedy staje się ona pożywką warunkowaną. Komórki z 16. dnia są następnie sortowane i wysiewane do pożywki półstałej w celu przeprowadzenia testu kolonogennego.

Struktura komórkowa; obraz mikroskopowy; analiza morfologii komórek; agregacja komórek.
Rycina 2. Reprezentatywna mikrofotografia dużych ciał embrionoidalnych w 6. dniu, pochodzących z mysich embrionalnych komórek macierzystych. Optymalne ciała embrionoidalne w 6. dniu mają średnicę co najmniej 150 μm i ciemniejsze centra (strzałki). Ekspresja wczesnych markerów progenitorów trzustki (takich jak Pdx-1 i Sox9) jest zwiększona w tych ciałach embrionoidalnych (dane nie pokazano).3

Wykresy cytometrii przepływowej pokazujące rozkład populacji komórek; obejmują FSC vs SSC, barwienie DAPI, FL1: EGFP.
Rycina 3. Bramki sortowania dla komórek wywodzących się z mES w 16. dniu, wykazujących ekspresję Ngn3-EGFP. (A) Bramki rozproszenia przedniego (Forward Scatter) i bocznego (Side Scatter), wskazujące odpowiednio na wielkość i ziarnistość komórek, eliminują zanieczyszczenia niekomórkowe. (B) DAPI jest stosowany do identyfikacji martwych komórek, które będą barwić się dodatnio przy pobudzeniu w zakresie 405-413 nm i detekcji emisji za pomocą filtra 450/40. (C) Szerokość impulsu (Pulse width), czyli szerokość elektronicznego impulsu rozproszenia przedniego, ujawnia dublety, które powinny zostać wyeliminowane przed przekazaniem do sortera komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). (D) Bramkowanie EGFP (kanał FL1) względem autofluorescencji z użyciem komórek w 16. dniu z kontrolnej linii rodzicielskiej, takiej jak TL1 (panel lewy), uwidacznia rzeczywistą fluorescencję, a tym samym populację komórek Ngn3-EGFP+ (panel prawy). (E) Czerwona strzałka pokazuje ręczne przesunięcie bramki EGFP+ w prawo tuż przed sortowaniem, aby zwiększyć separację fałszywie dodatnich komórek. Zdarzenia w punktach (D) i (E) są bramkowane na podstawie regionów (R1 - R3) pokazanych w (A-C).

Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej; powiększony fragment uwypukla skupisko komórek; skala 100μm.
Rycina 4. Reprezentatywne mikrofotografie kolonii wykazujących ekspresję insuliny w hodowli półstałej. Kolonie są rozmieszczone losowo i występują jako małe, ciemne, niewykazujące odblasków skupiska. Pojedyncze kolonie mogą być później poddane analizie ekspresji genów i białek odpowiednio za pomocą RT-PCR oraz immunohistochemii (nie pokazano; patrz wideo).

Schemat testu klonogennego; wzrost CFU dla insuliny, analiza komórek progenitorowych w podłożu półstałym.
Rysunek 5. Test kolonogenny umożliwiający funkcjonalną i ilościową ocenę pojedynczych komórek progenitorowych. Numeracja powstałych kolonii służy do obliczenia częstotliwości występowania komórek progenitorowych wśród wszystkich wysianych komórek. Skład komórkowy każdej kolonii wskazuje na potencjał różnicowania inicjującego ją progenitora. Wykorzystując ten test, stwierdzono, że komórki Ngn3-EGFP+ pochodzące z mysich embrionalnych komórek macierzystych były wzbogacone w jednostki tworzące kolonie wykazujące ekspresję insuliny (ICFU), czyli komórki progenitorowe zdolne do różnicowania się w kolonie wykazujące ekspresję insuliny.2

Tabela składu pożywek półstałych; składniki hodowli komórkowej, dodatki, objętości, stężenia.
Tabela 1. Składniki pożywek półstałych i kolejność ich dodawania.

Dyskusja

Dotychczas liczba testów kolonnych umożliwiających ilościową i funkcjonalną ocenę pojedynczych progenitorów trzustki była ograniczona, co znacznie utrudniało postępy w badaniach nad biologią komórek macierzystych i progenitorowych trzustki. Istotą testu kolonnego jest pomiar wewnętrznej zdolności komórek progenitorowych, a nie tylko ich fenotypu, co pozwala na obserwację funkcjonalności i potencjału linii komórkowych tych komórek. Jest to również narzędzie ilościowe, które pozwala określić liczbę progenitorów w danej populacji. W dziedzinie hematopoetycznych komórek macierzystych testy kolonne odegrały istotną rolę w ich identyfikacji, a także w rozszyfrowywaniu wymagań dotyczących czynników wzrostu, interakcji i mechanizmów sterujących różnicowaniem tych komórek w konkretne linie.6 W biologii komórek progenitorowych trzustki opracowano metody hodowli organoidów trzustki7,8 lub hodowle zbiorcze9-13, jednak testy te nie pozwalają na rozstrzygnięcie kwestii biologicznych na poziomie pojedynczej komórki. Bez analizy pojedynczych komórek nie można jednoznacznie udowodnić istnienia wielopotencjalnych komórek macierzystych/progenitorowych trzustki.14

W niniejszej pracy wykazujemy, że progenitorów tworzących kolonie i wykazujących ekspresję insuliny można analizować przy użyciu trójwymiarowego, półstałego systemu hodowlanego zawierającego Matrigel. Chociaż opracowano system hodowli w zawiesinie15,16, który pozwala pojedynczym dorosłym progenitorom trzustki na proliferację i różnicowanie w „pankreatosfery”, nasz test tworzenia kolonii zapewnia dodatkowe korzyści. Po pierwsze, nasz system półstałych mediów hodowlanych umożliwia wysiew do 25 000 posortowanych komórek na 500 μL medium w jednej studience płytki 24-dołkowej, przy jednoczesnym utrzymaniu tworzenia kolonii w zakresie liniowym.2 W przeciwieństwie do tego, test pankreatosfer w zawiesinie wymaga zastosowania metody depozycji pojedynczych komórek z sortera komórkowego w celu umożliwienia analizy pojedynczych komórek, co wiąże się z koniecznością użycia większej objętości medium oraz większej przestrzeni w inkubatorze. W związku z tym nasz test tworzenia kolonii jest stosunkowo łatwy i kosztowo efektywny do przeprowadzenia w sytuacjach, gdy konieczne jest jednoczesne porównanie aktywności progenitorowej dla dużej liczby różnych komórek. Po drugie, nasze półstałe medium zapewnia równomierny rozkład składników macierzy zewnątrzkomórkowej i czynników wzrostu, co pozwala na zachodzenie zarówno proliferacji, jak i różnicowania w tej samej studience. W przeciwieństwie do tego, trudniej jest zapewnić takie środowisko, a zwłaszcza macierz, komórkom w hodowli w zawiesinie. Mamy świadomość, że w przypadku naszej metody nie można jednoznacznie udowodnić, iż każda kolonia pochodzi z jednej komórki, ponieważ dwa progenitory mogą zostać przypadkowo rozmieszczone blisko siebie i utworzyć jedną kolonię. Problem ten można jednak rozwiązać poprzez analizę wtórną z wykorzystaniem manipulacji pojedynczymi komórkami. Bezpośrednie ręczne wyselekcjonowanie posortowanych pojedynczych komórek mogłoby jednoznacznie wykazać pochodzenie każdej kolonii z jednej komórki.

Podsumowując, opisana w niniejszym opracowaniu zdolność progenitorów do tworzenia kolonii wykazujących ekspresję insuliny w podłożach półstałych stwarza wyjątkowe możliwości prowadzenia badań mechanistycznych nad progenitorami trzustki na poziomie pojedynczych komórek. Na przykład w poprzednim raporcie stwierdziliśmy, że do powstania kolonii wykazujących ekspresję insuliny z komórek Ngn3-EGFP+ niezbędny jest dodatek do pożywki Matrigel, będący surową mieszaniną białek macierzy pozakomórkowej,2 co sugeruje, że macierz pozakomórkowa jest istotna dla tych progenitorów. Dzięki zastosowaniu tego testu koloniogennego możliwe będzie teraz dalsze analizowanie i określanie specyficznych wymagań dotyczących macierzy dla takiej aktywności. Oprócz badania progenitorów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych myszy, obecnie badamy, czy ten system testowy in vitro wspiera również tworzenie innych charakterystycznych kolonii pochodzących z trzustki i wątroby myszy okołoporodowych i dorosłych, a także z ludzkiej pośmiertnej tkanki trzustki pozbawionej wysepek.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr. Klausowi Kaestnerowi za przekazanie mysiej linii komórek macierzystych zarodkowych Ngn3-EGFP, pani Lucy Brown oraz Analytical Cytometry Core za pomoc w sortowaniu komórek. Praca ta była częściowo finansowana z grantów NIH R21DK069997 i R01DK081587 przyznanych H.T.K. oraz z grantów szkoleniowych California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) przyznanych M.W. i L.S.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1X DMEM/ F-12 (1:1)Mediatech, Inc.15-090-CV
Płytkowa surowica bydlęcaTissue Culture Biologicals201Patrz sekcja 1.1
L-glutaminaGIBCO, by Life Technologies25030-081
1X PBS Dulbecco’sMediatech, Inc.21-031-CV
Albuminy surowicy bydlęcejSigma-AldrichA84127.5 %
MatrigelBD Biosciences356231Z obniżoną zawartością czynników wzrostu
MetylocelulozaSinetsu Chemical1,500 centipoise (wysoka lepkość)
NikotynamidSigma-AldrichN0636
Rekombinowana ludzka aktywina βBR&D Systems659-AB-025
Exendin-4Sigma-AldrichE7144
Rekombinowany ludzki VEGF-AR&D Systems293-VE-010
Płytki 24-dołkoweCostar3473Ultra-niska
adhezja
Szalka Petriego 60mm z siatkąNalge Nunc international169558

Bibliografia

  1. Ku, H. T. Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro. Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).
  2. Ku, H. T. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
  3. Chen, C. Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis. Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).
  4. Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity. Genes. 16, 1488-1497 (2002).
  5. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
  6. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
  7. Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors. Development. 122, 439-447 (1996).
  8. Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).
  9. Bonner-Weir, S. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).
  10. Gao, R. Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture. Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).
  11. Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells. Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).
  12. Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).
  13. Hao, E. Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas. Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).
  14. Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
  15. Seaberg, R. M. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).
  16. Rovira, M. Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kolonie wykazuj ce ekspresj insulinytest na pod o u p sta ymkom rki NGN3 EGFPr nicowanie progenitor w trzustkihodowla w metylocelulozie z Matrigelemsortowanie metod cytometrii przep ywowejilo ciowa analiza RT PCRmikroskopia immunofluorescencyjnaprzygotowanie medium warunkuj cego

Powiązane artykuły